JC病毒蛋白VP3原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建JC病毒蛋白VP3原核表达载体,并观察其表达情况.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)获得VP3基因,将其连接到pGEM T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET 32a(+)中,转化BL21大肠杆菌,IPTG诱导,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)、Western blot免疫印迹分析鉴定融合蛋白的表达情况.结果 扩增获得VP3基因片段,成功构建了大肠杆菌原核表达JC病毒VP3载体.经IPTG诱导,得到了分子质量为59 ku的目的 蛋白,Western blot证实其具有良好的抗原性.结论 本研究成功表达了VP3蛋白,对于研究VP3蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础.     

硒蛋白S截短和全长重组质粒的构建与表达

目的构建截短和全长硒蛋白S(SelS)重组体,以期在细胞系中或动物体内高表达并观察其生物学效应。方法用基因重组技术构建SelS的截短体和全长的重组质粒,截短体基因只包含mRNA的编码序列(CDS),全长包括mRNA的CDS和3′非翻译区(UTR)序列,此序列中含硒代半胱氨酸的插入序列(SECIS)。将重组质粒送公司测序并比对。用脂质体2000将硒蛋白SelS质粒转染至细胞中,24h后观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞技术检测细胞的转染效率;收集细胞用Trizol法提取总RNA,将mRNA反转录为cDNA,以此为模板用PCR扩增以观察目的基因的表达。结果测序结果显示重组序列与目的基因完全一致,质粒构建成功。显微镜下可观察到细胞高表达绿色荧光蛋白,经流式细胞技术验证细胞的转染效率达到40%以上。PCR产物的凝胶电泳结果显示:与对照组及其他实验组相比,只有转染了目的基因的实验组高表达截短和全长的SelS基因。结论成功构建SelS截短的和全长的重组质粒并转染入细胞中高表达,对观察硒蛋白截短体和完整形式在细胞系或动物体内的生物学效应提供了基础。     

CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。     

迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定

目的 构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因.方法 采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出V_H和V_L可变区基因, 再通过重叠延伸拼接PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly_4ser)_3,体外构建单链抗体基因;将其克隆至表达载体pET-28a并在大肠杆菌中表达,表达产物纯化后,用SDS- PAGE、Western blot及ELASA进行鉴定.结果 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、纯化和体外复性,获得了高纯度的单链抗体片段,重组蛋白的分子质量为27 ku.ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力.结论 成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv,为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础.     

人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

目的 体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,并与其结构类似蛋白--截短型PrP(PrPΔ32-121)加以比较.方法 通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞后,观察蛋白表达及其定位情况;采用MTT实验检测转染细胞的生长状态;用流式细胞仪、Western blot等方法检测转染细胞的凋亡状态.结果 两种蛋白均可在转染细胞中表达,并存在于细胞膜上;MTT结果显示,在转染24h后均出现明显的细胞毒性作用;细胞凋亡相关实验发现,转染细胞Annexin V/PI双染阳性细胞数量增多,pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低.结论 瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用,并诱导启动细胞凋亡过程.     

人促甲状腺激素受体A亚单位蛋白在昆虫细胞体系中的分泌性表达

目的 拟构建昆虫细胞分泌表达体系,在草地夜蛾卵巢细胞分泌性促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR) A亚单位蛋白。方法 将TSHR A亚单位蛋白(22-289)和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)基因连接到质粒,并通过转化、蓝白斑筛选获得重组杆粒,将其转染入sf9昆虫细胞收获重组杆状病毒,扩增并测定滴度。最终通过蛋白印迹实验鉴定重组蛋白的表达并优化表达条件。结果 在蛋白表达体系的构建过程中,PCR鉴定和测序均证实了重组质粒和重组杆粒序列的正确性。将重组杆粒转染入细胞后观察到病毒出芽迹象,空斑实验鉴定P1代病毒的滴度为2×10⁷pfu/m。蛋白印迹显示重组蛋白分子质量为55 ku,主要在培养基中。蛋白表达的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1,最佳感染时程为72 h。结论 本研究构建了TSHR A亚单位的昆虫细胞杆状病毒表达体系,该体系能够外泌性表达分子质量为55 ku左右的蛋白TSHR 22-289,且蛋白能够成功...     

幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测

目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体,成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定后用含Ni 2+的His-bind树脂柱亲和层析纯化phoS2,并用Western blot对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明,成功构建了基因工程菌株高效表达质粒phoS2/pET32a。IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果显示,上清液中只见极少量的特异蛋白表达带,沉淀部分可见明显的特异表达带,说明phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的phoS2分子质量为37 953ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37 953.1ku,理论等电点为5.75,具有1个跨膜区,位于1¹9位,结构域位于119位,结构域位于1³70位。结论成功构建了结核分支杆菌phoS2/pET32a重组质粒,phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒C区截短型基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-Ct,转化HB101宿主菌,通过温度诱导表达截短型C蛋白。结果扩增得到目的基因长度为462bp,构建pBVIL1-Ct表达载体,在HB101宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达,表达蛋白占菌体总蛋白含量的24%。Western-Blot及ELISA检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论羧基端部分缺失的HCV C区基因片段可在大肠杆菌中稳定表达并具有良好的反应原性。     

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。     

诗画解读（二十七）

“葡萄美酒夜光杯,欲饮琵琶马上催。醉卧沙场君莫笑,古来征战几人回？”     

P27KIPL蛋白在卵巢浆液性肿瘤中的表达及意义

目的　探讨P2 7KIPL蛋白在卵巢浆液性肿瘤中的表达及其与生物学行为和预后的关系。方法　采用免疫组化SP法检测 88例卵巢浆液性肿瘤中P2 7KIPL蛋白的表达水平。结果　 6 1例卵巢浆液性囊腺癌中P2 7KIPL阳性表达率为 4 6 % (2 8/ 6 1例 ) ,明显低于浆液性囊腺瘤 80 % (12 / 15例 )和浆液性交界性肿瘤 75 % (9/ 12例 ) (P <0 0 5 )。P2 7KIPL阳性表达在Ⅰ级癌中表达率最高 73 3% ,Ⅱ级癌 4 6 7% ,Ⅲ级癌表达最低 12 5 %。三组之间差异显著 (P <0 0 5 ) ,P2 7KIPL阳性表达与组织分级呈负相关。早期 (Ⅰ Ⅱ期 )P2 7KIPL表达率 76 % ,明显高于晚期 (Ⅲ Ⅳ期 ) 2 7% (P <0 0 5 )。结论　P2 7KIPL蛋白表达水平可能与卵巢浆液性囊性癌组织分化、临床分期有关。     

27SiMnMoV钢渗碳工艺性能的研究

本文采用真空渗碳方法,以20CrMnTi 钢为对比对象,研究了27SiMnMoV 钢的渗碳工艺性能.结果表明:27SiMnMoV 钢与20CrMnTi 钢相比,渗碳层中碳化物细小;碳浓度梯度小;硬度分布平缓;力学性能指标α_k、σ_(bb)、f 均要高些.故27SiMnMov 钢的渗碳工艺性能优于20CrMnTi钢.     

重庆市轨道交通27号线快慢车模式研究

快慢车运营模式作为提升轨道交通运输效率的重要途径,在设计过程中充分论证其实施必要性及应用效果具有极其重要的意义及作用.以重庆市轨道交通27号线为例,结合线网规划、线路条件、客流特征等充分论证快慢车运营的必要性;综合能力折损、配线设置等确定越行方案;分析出行效率、车辆投资、土建追加及经济效益后,最终得出结论:重庆市轨道交通27号线宜按快慢车运营模式实施工程建设,运营期间视线路实际情况,推荐在平峰时段组织开行快慢车、高峰时段组织开行站站停列车.     

ZA27高阻尼合金的阻尼特性及微观机理的研究

研究了经过稀土、Ti变质处理和固溶自然时效处理的ZA27合金的阻尼特性,探讨了其阻尼机理,分析了变质处理及固溶自然时效处理对提高合金阻尼性能的作用。与铸态合金比较,经过变质、固溶自然时效处理后的合金,其阻尼性能有明显提高。阻尼性能提高是由于组织细化、界面增多以及位错增殖所致。     

KCR—27型窗式空调器制冷系统模拟与优化

针对ＫＣＲ－２７型窗式空调器制冷系统，建立数学和物理模型，进行计算机模拟，并以能效比最大和空调器年总费用最低为目标，采用序贯有约束极小化方法中的混合罚函数法，运用计算机技术，地ＫＣＲ－２７型空调器进行优化并提出改进设计方案。     

改性超细SiC粉体对ZA27合金耐磨性能的影响

对添加不同量(质量分数0～1％)改性超细SiC粉体的ZA27合金进行金相组织和耐磨性能研究.从添加粉体前后的ZA27合金组织对比发现:未添加粉体的ZA27合金组织中树枝晶比较发达,ε相呈网状分布,还有一定的尖角.随添加量增大,其中树枝晶变短,富Al-α相由树枝晶组织向等轴晶组织转变;加入量达到0.1％时,晶体尺寸进一步减小,且已基本转变为柱状组织,树枝晶组织的细化效果最优,ε相变得规整化;同时,随着添加量增加,磨损量降低,磨损率逐渐减小,加入量为0.1％时耐磨性能最佳,提高了30.4％.     

冠状动脉旁路移植术27例报告

本文报告１９８３年１０月至１９９３年５月期间我院２７例冠状动脉架桥（ＣＡＢＧ）手术。其中１９８７年前１例，１９８７年后２６例。术前均经冠状动脉造影（ＣＡ）证实病变。采用自体大隐静脉（ＳＶＧ）和（或）左乳内动脉（ＬＩＭＡ）作移植血管。全组死亡２例（７．４％），１９８７年后２６例中死亡１例（３．８％），２５例成活，随访５月～６年。心绞病消失率约８８％，心功能改善至Ⅰ纹２１例（８４％），Ⅱ级４例（１６％）．全部患者恢复工作，提示ＣＡＢＧ安全有效。     

CyclinD1和P27蛋白在人脑胶质瘤中的表达及其意义

目的　探讨人脑胶质瘤组织中CyclinD1和P2 7蛋白的表达及其相互关系。方法　采用SP免疫组化技术检测脑胶质瘤和非肿瘤组织中两者的表达 ,并用彩色图像分析系统作定量分析。结果　①两者的免疫反应复合物均定位于细胞核。②两者在脑胶质瘤中的表达均显著高于非肿瘤组织 ,且CyclinD1蛋白的表达强度随肿瘤恶性程度增加而升高 ,而P2 7蛋白的表达强度则随肿瘤恶性程度增高而下降 ,两者的表达呈显著负相关。③CyclinD1蛋白的表达强度愈高则预后愈差 ,而P2 7蛋白的表达强度愈低则预后愈差。结论　两者的异常表达可能与人脑胶质瘤的发生和发展有密切关系 ,且具有协同作用 ,其表达强度可客观地反映肿瘤的恶性程度和评价预后。     

2007年中国客车市场分析

总体来看,2007年,客车市场将在矛盾中实现增长,由于2006年客车行业的月度销量曲线具有逐步放缓的发展趋势,因此,我们认为2007年的增长幅度会低于2006年.