幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测

目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体,成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定后用含Ni 2+的His-bind树脂柱亲和层析纯化phoS2,并用Western blot对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明,成功构建了基因工程菌株高效表达质粒phoS2/pET32a。IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果显示,上清液中只见极少量的特异蛋白表达带,沉淀部分可见明显的特异表达带,说明phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的phoS2分子质量为37 953ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37 953.1ku,理论等电点为5.75,具有1个跨膜区,位于1¹9位,结构域位于119位,结构域位于1³70位。结论成功构建了结核分支杆菌phoS2/pET32a重组质粒,phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。     

定向基因传递载体pET15b-Z-VP1的构建

目的 在JCV VP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区),构建原核表达质粒pET15b-Z-VP1.方法 PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将Z-VP1片段插入原核表达质粒pET15b.结果经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化,分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成Z-VP1重组基因;双酶切将Z-VP1插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间,并经酶切鉴定和DNA测序证实.Western blotting证明pET15b-Z-VP1在体外表达重组蛋白VP1-Z.结论成功在VP1氨基末端插入Z区,构建了原核表达质粒pET15b-Z-VP1,并体外表达重组蛋白VP1-Z.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3全长基因的克隆和表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3,为进一步研究其基因功能奠定基础。方法设计特异性引物,以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因。将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,经酶切、PCR及测序鉴定后,与表达载体pET32a重组,后转入BL21菌株并诱导表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS3基因的蛋白表达水平。结果含有NS3的重组体构建成功并在大肠杆菌中表达。结论运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV非结构基因NS3蛋白,为尽一步研究HCVNS3基因功能奠定了基础。     

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。     

JC病毒蛋白VP3原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建JC病毒蛋白VP3原核表达载体,并观察其表达情况.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)获得VP3基因,将其连接到pGEM T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET 32a(+)中,转化BL21大肠杆菌,IPTG诱导,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)、Western blot免疫印迹分析鉴定融合蛋白的表达情况.结果 扩增获得VP3基因片段,成功构建了大肠杆菌原核表达JC病毒VP3载体.经IPTG诱导,得到了分子质量为59 ku的目的 蛋白,Western blot证实其具有良好的抗原性.结论 本研究成功表达了VP3蛋白,对于研究VP3蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础.     

CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得366bp的核心蛋白基因片段。将其插入连接载体pMD18-T vector中,酶切后再与表达载体pBV220连接,构建重组表达载体pBV220/HCV-C。经鉴定后温度诱导表达,采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测核心蛋白基因的蛋白表达。结果经温度诱导后获得目的基因的非融合表达,SDS-PAGE电泳显示在14000 u处有一表达条带;Western-blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论丙型肝炎病毒核心蛋白基因成功表达,对临床诊断试剂和HCV基因疫苗的研制有一定的意义。     

丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒（HCV）1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV1bDY株全长eDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18-Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET-28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体，并得以表达。结论成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因，为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的Ns5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。     

多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗的构建及其表达效率

目的构建多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-Em14-3-3疫苗,并研究Em14-3-3分子在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法通过PCR扩增Em14-3-3抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗。经PCR和酶切鉴定后以IPTG诱导表达Em14-3-3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR成功扩增出530 bp的Em14-3-3基因;双酶切证实Em14-3-3基因插入pGEX-1λT中;PCR证实重组Bb-Em14-3-3疫苗构建成功;SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了Em14-3-3/GST融合蛋白,表达效率为23%。结论成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-Em14-3-3疫苗,重组质粒pGEX-Em14-3-3在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot结果提示表达出的Em14-3-3重组蛋白具有特异抗原性。