CHD4蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的构建CHD4/Mi-2β基因的截短体原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达并对GST融合蛋白进行纯化和初步鉴定。方法采用PCR方法扩增CHD4/Mi-2β的染色质调节区(CHD4-C)、解螺旋酶模序(CHD4-H)及DNA结合区(CHD4-D)基因片段,将目的基因片段插入原核表达载体pGEX-5T构建带GST标签的重组质粒,阳性克隆行DNA序列测定。IPTG诱导GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H原核表达,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,并对融合蛋白Western blot鉴定。结果构建了3个CHD4/Mi-2β基因的截短体重组质粒;IPTG诱导显示,GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白主要以可溶性蛋白形式在细胞裂解液上清中表达,表达产物的相对分子质量分别为130、110、90ku。谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白,纯化产物的纯度最高可达94.5%。Western blot证实各融合蛋白与抗GST单克隆抗体发生特异性结合反应,分子质量与估计值相符,提示为GST融合表达的CHD4/Mi-2β截短体蛋白。结论成功纯化了较高纯度的GST-CHD4-C、GST-CHD4-D和GST-CHD4-H融合蛋白,为进一步研究CHD4蛋白在染色质重塑中的作用奠定了实验基础。     

结核杆菌DnaA蛋白的原核表达及免疫血清的制备和检测

目的 在大肠杆菌中表达重组结核杆菌DnaA蛋白,对表达产物进行纯化、鉴定后制备DnaA蛋白特异性免疫血清并进行Western blot检测.方法 以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组为模板,PCR扩增DnaA基因,构建DnaA原核表达质粒pET-DnaA,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表...     

幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。     

SIK2 cDNA及其截短体原核表达重组体的构建及表达

目的构建SIK2cDNA及其截短体的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达。方法分别设计SIK2及其截短体引物,采用PCR方法分别扩增SIK2、SIK2-Δ1(280⁹26)、SIK2-Δ2(400926)、SIK2-Δ2(400⁹26)、SIK2-Δ3(1926)、SIK2-Δ3(1⁴00)、SIK2-Δ4(700400)、SIK2-Δ4(700⁹26)五个cDNA片段,并将扩增的cDNA片段插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST标签的重组质粒。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导SIK2、SIK2-Δ1、SIK2-Δ2、SIK2-Δ3和SIK2-Δ4五个截短体的原核表达,用考马斯亮蓝染色和Western blot进行鉴定。结果成功构建了SIK2全长及其截短体cDNA的重组质粒,用考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定显示,SIK2全长及其截短体重组质粒均在大肠杆菌中诱导表达。结论在大肠杆菌中成功地诱导表达了SIK2重组蛋白及其截短体,为进一步研究SIK2各结构域的功能提供了实验基础。     

人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒载体,为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒,再将其与酶切线性化的pDC315-3Flag载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag;应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒,进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定;用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag的构建;再通过荧光显微镜和Western blot方法,分别检测质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP-1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析,证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag与设计一致;穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后,经Western Blot均检测出在95¹30ku处有条特征带,其大小和NRP-1-3Flag融合蛋白(104ku)相吻合;滴度测定为2.00E+11PFU/mL。结论成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达。     

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定

目的 克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBC E2)全长编码序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做充分准备.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBC E2基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,并使用Western blotting分析其免疫反应性.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-UBC E2构建成功,该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21/DE3得到高效表达,亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明其有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫UBC E2可在原核表达系统中表达,并具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能奠定基础.     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测

目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体,成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定后用含Ni 2+的His-bind树脂柱亲和层析纯化phoS2,并用Western blot对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明,成功构建了基因工程菌株高效表达质粒phoS2/pET32a。IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果显示,上清液中只见极少量的特异蛋白表达带,沉淀部分可见明显的特异表达带,说明phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的phoS2分子质量为37 953ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37 953.1ku,理论等电点为5.75,具有1个跨膜区,位于1¹9位,结构域位于119位,结构域位于1³70位。结论成功构建了结核分支杆菌phoS2/pET32a重组质粒,phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。     

JC病毒蛋白VP3原核表达载体的构建及诱导表达

目的 构建JC病毒蛋白VP3原核表达载体,并观察其表达情况.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)获得VP3基因,将其连接到pGEM T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET 32a(+)中,转化BL21大肠杆菌,IPTG诱导,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)、Western blot免疫印迹分析鉴定融合蛋白的表达情况.结果 扩增获得VP3基因片段,成功构建了大肠杆菌原核表达JC病毒VP3载体.经IPTG诱导,得到了分子质量为59 ku的目的 蛋白,Western blot证实其具有良好的抗原性.结论 本研究成功表达了VP3蛋白,对于研究VP3蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础.     

固体超强酸SO2-4/TiO2-Fe2O3的制备及其光催化性能

采用共沉淀-浸渍法制备了SO2-4/TiO2-Fe2O3固体超强酸催化剂,通过样品光催化降解酸性蓝染料,考察了制备条件对染料脱色率的影响.结果表明,当固体酸中nTi和nFe的配比为1∶1,陈化pH为9～10,硫酸浸渍液浓度为0.5 mol/L,在500 ℃下焙烧4 h时制得的催化剂具有最高的催化活性. SO2-4/TiO2-Fe2O3固体超强酸再生后催化活性基本不变,可重复使用.     

纳米固体超强酸SO4^2-／ZrO2-La2O3催化合成环己烯研究

制备了纳米固体超强酸催化剂SO42-/ZrO2-La2O3,并利用该催化剂催化合成了环己烯,探讨了SO42-/ZrO2-La2O3对环己醇脱水生成环己烯反应的催化活性,较系统地研究了La3 离子浓度、硫酸浓度、焙烧温度、催化剂用量、反应温度和反应时间等因素对产品环己烯收率的影响.实验结果表明,SO42-/ZrO2-La2O3是催化环己醇脱水生成环己烯的良好催化剂,在La3 离子浓度为0.09 mol.L-1,硫酸浓度1.0 mol.L-1,焙烧温度为500℃、焙烧时间3 hr,催化剂用量为环己醇质量的5%,反应温度为180℃,反应时间为60 min,收率达80.66%.     

民用建筑三相配电中性线电流的确定

本文引入相量负载系数β_k(k=1,2,3)来描述电路中三相负载的动态变化,通过对常见的三相四线电路的分析,从理论上获得了中性线电流上限值的计算公式。文中的分析方法和结论对配电设计有一定的参考价值。     

没食子酰基金丝桃甙的抗氧化性及其构效关系研究

目的　通过对没食子酰基金丝桃甙 (Gq)清除氧自由基作用的测定 ,探讨Gq的抗氧化性并对其抗氧化机理与结构之间的关系进行探讨。方法　分别采用黄嘌呤 黄嘌呤氧化酶体系及Fenton反应体系 ,测定Gq对超氧阴离子自由基 (SAFR)和羟基自由基 (HFR)的清除作用 ,得出清除率与浓度之间的相关关系 ,求出IC50 值 ,以表示其抗氧化能力。对比分析Gq及天然抗氧剂槲皮素和芦丁的化学结构 ,探讨抗氧化机理与结构之间的构效关系。 结果　Gq对氧自由基具有明显的清除活性 ,清除SAFR和HFR的IC50 值分别为 4 0 .8μmol·L-1和 33.5 μmol·L-1,远小于阳性对照物槲皮素 (分别为 114 .0 μmol·L-1和 10 0 .8μmol·L-1)及芦丁 (15 2 .0 μmol·L-1和 91.4 μmol·L-1)。结论　Gq具有明显的抗氧化性 ,其抗氧化活性与其分子结构中多元酚结构有关 ,但其抗氧化机理不同于小分子的没食子酰类衍生物     

1,25-(OH)2D3及复方丹参对大鼠异基因骨髓移植后造血重建及T细胞亚群的影响

目的 观察1,25-(OH)2D3及丹参对异基因骨髓移植(Allo-BMT)后造血重建和T细胞亚群的影响.方法 受鼠随机分成4组:A组(急性移植物抗宿主病,即aGVHD组),B组(1,25-(OH)2D3组),C组(丹参组),D组(两药联合组).观察大鼠生存期、外周血象、aGVHD的临床表现及T细胞亚群.结果各药物干预组与aGVHD组相比,其aGVHD的发病时间延迟、aGVHD评分降低、平均生存时间明显延长,差异均有统计学意义(P<0.05);各药物干预组外周血象恢复较快,在各不同时间点的变化均高于aGVHD组,差异亦有统计学意义(P<0.05);经干预方案处理后,CD4+、CD8+的数值明显较aGVHD降低,以CD4+细胞下降明显,而aGVHD时二者均明显增加,CD4+/CD8+的比值增大,结论 1,25-(OH)2D3及复方丹参在异基因骨髓移植后对减轻aGVHD、促进造血重建及发挥免疫耐受有积极的作用.     

基于SH—MobileL3V的DMB播放器设计

详细介绍了SH—Mobile处理器和全球主要DMB标准，设计和开发了一个面向ISDB—T标准的DMB播放器。播放器的硬件部分由射频模组和基带电路2个部分构成，可以接收ISDB—T（1 segment）频段下的射频信号及播放SD卡的存诸内容，具有抗干扰能力强、信号稳定、功耗小且播放流畅的优点，有效地实现了手持数字电视的功能。     

miR-125a-3p和miR-17-5p在激素性股骨头坏死中的作用

目的探讨激素性股骨头坏死中miRNA的差异性表达变化。方法取激素性股骨头坏死的坏死区域骨组织为实验组,其股骨颈基底部骨组织为对照组;分别提取总RNA并进行质检;采用miRNA芯片技术检测miRNAs的表达并对其表达谱进行分析;运用实时定量PCR对差异明显的miR-125a-3p和miR-17-5p进行验证。结果对激素性股骨头坏死中miRNA表达谱进行差异性分析。和对照组相比,实验组中倍数大于2倍,P<0.05的miRNA共有11个。8个miRNA表达上调,3个表达下调。实时定量PCR证实miR-125a-3p在坏死标本中高表达,而miR-17-5p呈现低表达,与miRNA芯片结果一致。结论激素性股骨头坏死区域骨组织与对照组相比miRNAs表达发生明显变化,以miR-125a-3p和miR-17-5p差异最为明显。这表明了它们最有可能参与了激素性股骨头坏死病理过程的调控。     

跨海斜拉桥斜拉索安装施工方案简析

结合工程实例,介绍了斜拉索安装工况索力分析及相关参数,阐述了跨海斜拉桥斜拉索安装施工方案。     

高职教育“1-2-2-1”思路的实践性解读

对高职教育＂建设一个管理平台、两个办学系统、两个证书和一个回炉＂的＂1-2-2-1＂思路进行实践性解读,分析该思路提出的必要性和实际操作策略,论证该思路对我国高职教育当前发展的现实意义。     

斜拉桥换索设计研究

以一座斜拉桥的换索工程为背景,设计了两种换索方案,分别对两种方案做了换索过程分析。通过将所得到的计算结果进行比较,选择合理的换索方案。