尾型同源盒基因-2过表达对结肠癌细胞生物学性状的影响

目的观察尾型同源盒基因-2(CDX2)对结肠癌细胞生物学性状的影响,探讨CDX2基因在结肠癌发生发展中的作用。方法克隆人结肠CDX2基因,构建含CDX2的pEGFP-C1-CDX2表达载体,同时设pEGFP-C1空载体组及空白对照组。利用脂质体法将pEGFP-C1-CDX2和pEGFP-C1质粒分别转染Lovo细胞,应用Western blotting技术检测Lovo细胞中CDX2基因的表达;应用MTT法及流式细胞仪检测CDX2对Lovo细胞增殖、凋亡及周期的影响;应用ELISA法检测CDX2过表达对Lovo细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。结果成功构建含CDX2真核表达载体。瞬时转染pEGFP-C1-CDX2的Lovo细胞48 h有较高水平的CDX2蛋白的表达;与pEGFP-C1空载体组及空白对照组比较,转染pEGFP-C1-CDX2组的Lovo细胞在转染72 h时生长未见明显抑制,G1期及S期所占比例无明显改变,凋亡率亦无明显增加(P均>0.05),但MMP-2分泌明显减少(P<0.05)。结论 CDX2过表达对Lovo细胞增殖、凋亡及周期无明显影响,但能够明显减弱Lovo细胞的侵袭力,从而对结肠癌浸润转移起抑制作用。     

双靶向诱导超抗原TSST-1基因重组逆转录病毒的包装及鉴定

目的包装出携5拷贝缺氧反应元件(5 HRE)增强子和癌胚抗原启动子(CEAp)联合调控的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)基因的逆转录病毒,并建立稳定表达TSST-1的人结肠癌Lovo细胞株。方法应用已构建好的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5 HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM,与辅助质粒pMB-MLV、pMB-G共转染入293T细胞,LaSRT法检测病毒滴度。包装出的逆转录病毒感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo和CEA阴性的人宫颈癌细胞株Hela。应用RT-PCR和免疫组化方法鉴定TSST-1的表达。结果获得重组逆转录病毒滴度约为1×106CFU/mL。RT-PCR及免疫组化证实经病毒感染的Lovo细胞在mRNA和蛋白水平均有TSST-1表达,缺氧环境中的mRNA表达量更高,且细胞传代20次后依然有TSST-1 mRNA表达;经病毒感染的Hela细胞在常氧或缺氧状态下均无TSST-1 mRNA及蛋白表达。结论包装出较高滴度重组逆转录病毒,并能靶向性在CEA阳性肿瘤内稳定表达TSST-1,为后续检验TSST-1对肿瘤的杀伤效应奠定了基础。     

非洛地平对ox-LDL损伤的人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶mRNA及一氧化氮表达的影响

目的 探讨非洛地平对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA及一氧化氮(NO)表达的影响.方法 将原代细胞分为空白对照组、ox-LDL(6、12.5、25mg/L)损伤组、非洛地平(0.1、1.0、10μmol/L)+ox-LDL(25mg/L)干预组,采用实时荧光定量PCR技术检测eNOS、iNOS的mRNA水平,硝酸还原酶法测定培养上清中NO的浓度.结果 ox-LDL损伤内皮细胞后,eNOS、iNOS mRNA及NO较空白对照组升高;非洛地平下调ox-LDL损伤的内皮细胞iNOS的表达,增加其NO的生成.结论 非洛地平可抑制低浓度ox-LDL诱导的iNOS mRNA表达,增加NO的生成,发挥其保护内皮细胞的功能.     

人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒载体,为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒,再将其与酶切线性化的pDC315-3Flag载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag;应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒,进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定;用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag的构建;再通过荧光显微镜和Western blot方法,分别检测质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP-1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析,证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag与设计一致;穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后,经Western Blot均检测出在95¹30ku处有条特征带,其大小和NRP-1-3Flag融合蛋白(104ku)相吻合;滴度测定为2.00E+11PFU/mL。结论成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达。     

小鼠胚胎成纤维细胞对Lewis肺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是否具有肿瘤相关成纤维细胞相似的生物学活性.方法 原代培养MEF并经细胞免疫组化法鉴定α-SMA的表达情况;收集培养48h无血清高糖DMEM培养基上清并制备条件培养基MEF-CM,根据实验中Lewis肺癌细胞(LLC)细胞培养基不同,分为MEF条件培养基组、DMEM组,应用MTT法...     

非洛地平对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的 研究非洛地平(felodipine)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活性氧(ROS)及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)mRNA表达的影响,探讨其独立于降血压外的抗动脉粥样硬化的作用机制.方法 筛选ox-LDL与HUVECs细胞孵育最适的干预浓度梯度与时间,然后与不同浓度的非洛地平(0.1、1、10μmol/L)共同孵育24h,流式细胞仪测定细胞内ROS,real time-PCR检测细胞ICAM-1、VCAM-1mRNA的表达.结果 ox-LDL对HUVECs内ROS的产生呈浓度依赖效应,随着刺激浓度的升高,ROS产生增多,25mg/L ox-LDL作用最为显著(P<0.01),非洛地平可抑制ox-LDL诱导的HUVECs ROS(P<0.05)的产生;随ox-LDL刺激浓度的增加,ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达逐渐上调,当浓度达到25mg/L时,作用最为显著(P<0.05),非洛地平可下调ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达(P<0.05).结论 非洛地平可抑制ox-LDL诱导的HUVECs ROS的产生以及下调ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达,发挥抗氧化抗炎的内皮保护功能.     

缺血预处理对大鼠小肠移植后肠黏膜的保护作用

目的探讨缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)对缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)大鼠肠黏膜屏障的保护作用。方法建立SD大鼠小肠移植模型;实验分为3组(n=8):假手术组(S)、缺血-再灌注组(I/R)组和缺血预处理组(IPC);观察小肠病理组织形态学变化,检测比较各组大鼠肠黏膜丙二醛(malondialchehyche,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性以及肠黏膜细胞凋亡发生率与分布及其凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果与I/R组相比,IPC大鼠小肠组织病理形态学明显改善(P<0.05),肠组织MDA含量和MPO活性均显著降低(P<0.05),而SOD活性则明显升高(P<0.05);肠黏膜细胞凋亡率明显下降(P<0.05);凋亡相关蛋白Bcl-2表达明显增加(P<0.05);而Bax蛋白表达明显减少。结论 IPC可减轻移植大鼠I/R损伤,与抗氧化作用增强和小肠肠黏膜细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达调控而抑制肠黏膜细胞凋亡有关。