三阴性乳腺癌差异表达miRNA的筛选

目的应用miRNA芯片技术筛选三阴性乳腺癌及癌旁组织差异表达的miRNAs,为进一步阐明其在三阴性乳腺癌发病机制中的作用奠定基础。方法收集8例新鲜的三阴性乳腺癌及其癌旁组织,抽提总RNA进行Hy3荧光标记,miRCURYTMLNA Array(v.16.0)(Exiqon)芯片上进行杂交反应,实时定量PCR验证miRNAs芯片结果的可靠性。结果对芯片进行图像扫描和数据分析,筛选获得17个三阴性乳腺癌相关miRNAs,其中7个miRNAs表达上调,10个miRNAs表达下调;显著上调的有miR-93、miR-328,显著下调的有miR-145、miR-205。结论筛选得到三阴性乳腺癌miRNA差异表达谱,其可能与三阴性乳腺癌的发生发展有关。     

miR-384-5p通过阻断BMP7转录后调控促进肾纤维化

目的研究miR-384-5p是否通过调节肾小管上皮细胞BMP7转录而影响肾纤维化。方法建立小鼠单侧输尿管阻塞模型(unilateral ureteral obstructive, UUO),流式细胞仪荧光激活细胞分选(FACS)分离肾组织获取肾小管上皮细胞进行培养,通过脂质体转染表达miR-384-5p的质粒、表达反义miR-384-5p的质粒及空白质粒;静脉注射空质粒(n=10)或反义-miR-384-5p质粒(n=10),14周后处死UUO模型小鼠,肾组织切片进行Masson三色染色评估肾纤维化程度;Western blot和实时定量PCR检测miRNA靶基因(miR-384-5p、miR-30、miR-92和miR-128)表达。结果 UUO模型14 d时肾脏出现明显纤维化,肾组织BMP7 mRNA明显增加,但BMP7蛋白无明显增加。miR-384-5p没有影响肾小管上皮细胞中BMP7 mRNA表达,但是过表达miR-384-5p的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白明显减少,过表达反义miR-384-5p的肾小管上皮细胞中BMP7蛋白明显增加。免疫组化和定量PCR检测结果显示,UUO小鼠14 d肾组织纤维化显著增加,而注射反义miR-384-5p组肾组织纤维化程度明显减轻。虽然反义-miR-384-5p处理后不影响BMP7 mRNA水平,但能明显增加肾脏组织BMP7蛋白表达,提示抑制miR-384-5p能减轻UUO大鼠的肾损伤。结论 miR-384-5p是调节肾损伤后纤维化机制的关键因子,靶向miR-384-5p有希望成为防治肾脏纤维化的新方法。     

miR-148a-3p通过抑制钙网蛋白表达改善高糖诱导的心肌细胞线粒体损伤与凋亡

目的 评估miR-148a-3p对钙网蛋白(calreticulin, CRT)表达的影响以及对高糖培养下心肌细胞线粒体功能的调节作用。方法 利用miR-148a-3p minic、inhibitor干预H9c2大鼠心肌母细胞,检测CRT蛋白表达水平。再将细胞分为对照组、高糖组、高糖+miR-148a-3p minic组、高糖+miR-148a-3p minic+TG(CRT激动剂)、高糖+miR-148a-3p inhibitor组、高糖+miR-148a-3p inhibitor+CRT-(CRT-siRNA)组,检测三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量与活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)水平、细胞线粒体呼吸链复合酶活性与细胞凋亡水平。结果 miR-148a-3p minic明显抑制心肌细胞内CRT蛋白表达,miR-148a-3p inhibitor使CRT表达水平升高。miR-148a-3p minic抑制了高糖诱导的心肌细胞内的ATP生成减少、ROS生成增多、线粒体呼吸链复合酶活性减弱及细胞过度凋亡;而TG...     

miR-3127-5p靶向抑制Cdk10表达促进肝癌细胞迁移与侵袭

目的探究miR-3127-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达情况、临床意义及作用机制。方法实时定量PCR (qPCR)检测miR-3127-5p在HCC组织与癌旁组织、正常肝细胞(L02)与HCC细胞系中的表达情况;TCGA数据库分析正常肝组织及肝癌组织中miR-3127-5p的表达差异;分析miR-3127-5p的表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系;在HCCLM3细胞中敲减miR-3127-5p,Transwell实验来检测细胞侵袭及迁移能力;TargetScan数据库预测miR-3127-5p下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验加以验证。结果与癌旁组织和正常肝细胞相比,miR-3127-5p在HCC组织及细胞系中均高表达(P<0.05),与门静脉癌栓(P=0.016)及TNM分期(P=0.016)有关;基于TCGA数据库数据的生存分析显示,miR-3127-5p高表达与不良预后相关(P=0.002);在HCCLM3细胞中敲减miR-3127-5p抑制细胞的侵袭及迁移;通过生物信息学预测并通过双荧光素酶报告基因实验证实细胞周期素依赖性激酶10(cyclin-dependent kinase 10, Cdk10)是miR-3127-5p的直接靶基因,回复实验证实Cdk10介导了miR-3127-5p对肝癌细胞侵袭及迁移能力的促进作用。结论在HCC中miR-3127-5p通过靶向抑制抑癌基因Cdk10从而促进肝癌细胞侵袭及迁移。     

miR-3691-5p靶向抑制TET1表达促进肝癌细胞迁移与侵袭

目的探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中miR-3691-5p的表达、临床意义及作用机制。方法实时定量PCR(qPCR)检测miR-3691-5p在HCC组织与癌旁组织、正常肝细胞(L02)与HCC细胞系中的表达;TCGA数据库分析正常肝组织及肝癌组织中miR-3691-5p的表达差异,分析miR-3691-5p的表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系;在MHCC97-H细胞中敲减miR-3691-5p,Transwell实验评价细胞侵袭及迁移能力;TargetScan数据库预测下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验加以验证。结果与癌旁组织和正常肝细胞相比,miR-3691-5p在HCC组织及细胞系中均呈现高表达(P<0.05),并与门静脉侵犯(P=0.006)、TNM分期(P=0.008)及Edmondson分级(P=0.001)有关;基于TCGA数据库数据的生存分析显示,miR-3691-5p高表达与不良预后相关(P=0.016);在MHCC97-H细胞中敲减miR-3691-5p抑制细胞的侵袭及迁移;通过生物信息学预测并通过双荧光素酶报告基因实验证实,TET1(Ten-Eleven Translocation 1)是miR-3691-5p的直接靶基因,回复实验证实TET1介导了miR-3691-5p对肝癌细胞侵袭及迁移能力的促进作用。结论 miR-3691-5p在HCC中通过靶向抑制抑癌基因TET1促进肝癌细胞侵袭及迁移。     

川芎提取物通过miR-23a-3p/SNCA轴对帕金森综合征模型MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的影响

目的 探究川芎提取物对MPP⁺诱导的SH-SY5Y细胞和帕金森综合征的影响。方法 1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP⁺)干预SH-SY5Y建立帕金森综合征细胞模型(SH-SY5Y-MPP⁺),川芎提取物干预后检测细胞增殖、凋亡以及miR-23a-3p、SNCA的表达情况。另观察调控miR-23a-3p、SNCA表达后SH-SY5Y-MPP⁺的变化,双荧光素报告酶验证miR-23a-3p与SNCA的关系。结果 SH-SY5Y-MPP⁺的细胞增殖能力明显低于SH-SY5Y,而凋亡率则高于SH-SY5Y(P<0.05)。川芎提取物干预下,SH-SY5Y-MPP⁺的增殖能力、Bcl-2、SNCA蛋白升高,凋亡率与miR-23a-3p、Bax蛋白降低(P<0.05)。沉默miR-23a-3p与升高SNCA均可以促进SH-SY5Y-MPP⁺的增殖能力,抑制凋亡;而升高miR-23a-3p与沉默SNCA则反之(P<0.05)。在线靶...     

miR-338-3p在恶性肿瘤中的表达异常及其表观遗传组蛋白的修饰位点

目的探讨不同种类肿瘤中miR-338-3p表达谱及其表达异常的表观遗传修饰调控机制。方法生物信息学大数据库(TCGA Pan-Cancer)分析miR-338-3p在15种不同种类肿瘤组织中的表达谱;以胃癌为研究对象,分析数据库中45例正常胃组织和366例胃癌组织中miR-338-3p表达情况;CRCH37数据库预测miR-338-3p上游启动子区组蛋白修饰位点;利用染色质免疫共沉淀获取组蛋白结合的DNA,PCR扩增miR-338-3p启动子区片段,凝胶电泳验证PCR产物。结果 miR-338-3p在包括食道癌(ESCA)等不同种类肿瘤中表达异常,其中ESCA、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、肾乳头状肾细胞癌(KIRP)、肺鳞癌(LUSC)和甲状腺癌(THCA)中表达显著下调(P<0.05),而在结肠腺癌(COAD)、肾透明细胞癌(KIRC)和肝细胞肝癌(LIHC)表达显著上调(P<0.05);366例胃癌组织中miR-338-3p表达普遍下调;染色质免疫共沉淀结合PCR证实组蛋白H3K9m2和H3K4m3是可能引起miR-338-3p下调的两个修饰位点。结论 miR-338-3p在胃癌中表达下调,组蛋白H3K9和H3K4甲基化修饰是潜在原因。     

miR-450b-5p在肝细胞癌中的表达及功能

目的探究miR-450b-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况、临床意义及生物学功能,并初步探究其潜在的作用机制。方法 Real-time PCR检测miR-450b-5p在HCC组织和细胞系的表达情况;分析miR-450b-5p的表达水平与HCC临床病理特征及患者预后的相关性,并用Cox多因素回归分析法分析患者的独立预后因素;采用Transwell迁移和侵袭实验检测miR-450b-5p对HCC细胞迁移与侵袭能力的影响;MTT实验观察miR-450b-5p对HCC细胞增殖能力的影响;应用生物信息学工具预测miR-450b-5p的下游靶点,并应用荧光素酶报告实验及Western blot分析miR-450b-5p对靶点的调节作用。结果 miR-450b-5p在HCC组织和细胞系中的表达均明显降低(均P<0.001);miR-450b-5p的表达水平与肿瘤大小(P=0.026)、静脉侵犯(P=0.013)、TNM分期(P=0.020)及HCC患者的预后(P=0.014 2)相关,且Cox多因素回归分析结果显示miR-450b-5p为HCC患者的独立预后因素之一;上调MHCC-97H细胞的miR-450b-5p表达后,细胞迁移、侵袭和增殖能力显著被抑制;而下调Hep3B的miR-450b-5p表达时,细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显增强;生物信息学分析发现,性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box2,SOX2)可能是miR-450b-5p的作用靶点;荧光素酶报告实验显示,miR-450b-5p能够负向调节SOX2-3′UTR的荧光素酶活性;miR-450b-5p mimics能降低MHCC-97H细胞中SOX2的表达水平,miR-450b-5p inhibitors能上调Hep3B细胞中SOX2的表达水平。结论 miR-450b-5p通过靶向作用于SOX2抑制HCC细胞的迁移、侵袭及增殖,进而抑制HCC的发生发展。     

子宫内膜癌干细胞分化过程中microRNA表达谱的鉴定及分析

目的筛选子宫内膜癌干细胞分化过程中差异表达的microRNAs(miRNAs)并进行初步鉴定。方法无血清悬浮培养法富集子宫内膜癌干细胞,贴壁培养获得其分化细胞。利用microRNA芯片比较肿瘤干细胞及其分化细胞之间miRNAs的表达差异,挑选出有显著差异的miRNAs,通过RT-qPCR进行验证,应用TargetScan等数据库预测其靶基因;同时,芯片检测肿瘤干细胞及其分化细胞之间基因表达的差异,结合预测的miRNAs靶基因进行综合分析。结果 microRNA芯片筛选得到子宫内膜癌干细胞及其分化细胞之间差异表达(相差倍数2倍以上)的miRNAs有11个,其中在肿瘤干细胞中表达上调的miRNAs 10个,分别为miR-522、miR-139-3p、miR-520c-5p、miR-518d-5p、miR-146b-5p、miR-34a、miR-526a、miR-193a-3p、miR-221、miR-4674;在肿瘤干细胞中低表达的miRNA 1个,为miR-760。RT-qPCR检测结果显示,除miR-526a、miR-4674以外,其余9个miRNAs在肿瘤干细胞及分化细胞间的相对表达量均存在显著差异,与芯片检测结果一致。TargetScan、miRanda及miRTarBase在线数据库的交集中,筛选的miRNAs均可预测到靶基因。基因芯片检测肿瘤干细胞及其分化细胞,表达有显著性差异的基因共445个,其中207个在肿瘤干细胞中高表达,238个在肿瘤干细胞中低表达,与预测的miRNAs靶基因进行综合分析后发现,除miR-139-3p外,两者均有交集。结论子宫内膜癌干细胞分化过程中部分miRNAs的表达具有显著性变化,对此进行深入探索将为肿瘤干细胞的分化机制研究提供新的线索。     

miR-101-5p通过靶向ATAD2抑制肺鳞癌细胞的侵袭

目的 探讨微小RNA-101-5p(miR-101-5p)影响肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma, LUSC)细胞增殖、侵袭的分子机制。方法 从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库下载肺鳞癌TCGA-LUSC的miRNA成熟体表达数据和总RNA的测序数据,鉴定差异表达基因;分析富集于ATAD2的信号通路。培养LUSC细胞,qRT-PCR检测细胞中miR-101-5p和ATAD2的mRNA表达,MTT实验、克隆形成实验和侵袭实验检测miR-101-5p对LUSC细胞增殖和侵袭的影响,流式细胞术检测ATAD2对LUSC细胞周期的影响,Western blotting检测ATAD2蛋白的表达。双荧光素酶实验验证miR-101-5p能否与ATAD2靶向结合,最后通过LUSC细胞共转染oe-ATAD2和miR-101-5p模拟物(mimic),检测细胞增殖、克隆、侵袭能力的变化,进一步探究miR-101-5p能否通过ATAD2调节LUSC细胞的生物学功能。结果 miR-101-5p在LUSC组织及培养LUSC细胞中显著下...     

小鼠肌肉组织特异性微小RNA miR-133a腺病毒表达载体的构建及表达

目的制备小鼠肌肉组织特异性微小RNA miR-133a的腺病毒表达载体并观察其在HeLa细胞的表达。方法利用PCR技术从小鼠基因组DNA扩增miR-133a前体对应的基因组片段,克隆到质粒pAdTrack-CMV,而后以同源重组的形式插入到腺病毒表达载体,由人胚肾293细胞包装,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。重组腺病毒感染HeLa细胞后,利用Northern blot检测miR-133a成熟分子的表达。结果①成功构建穿梭质粒pAdTrack-miR-133a;②成功构建重组腺病毒质粒pAdeasy-miR-133a;③293细胞包装获得有感染能力的重组腺病毒;④转染的HeLa细胞能够高效表达成熟miR-133a。结论构建了小鼠miR-133a的腺病毒表达载体,证实其转染HeLa后的表达,为后续研究miR-133a的功能打下了基础。     

对等网络视频点播系统中的用户行为研究

随着p2p VoD业务的快速增长,用户行为对整个系统性能的影响也越来越明显.掌握用户行为特点对提高p2p网络带宽利用率、优化资源替代算法、调整服务器带宽分配策略等一系列问题有重要的指导意义.本文通过分析实测VoD系统中的用户日志数据,建立了数学模型描述用户观看行为.仿真结果表明,该模型能够较为准确的反映用户行为的统计特征,较为全面地刻画出整个VoD系统中用户行为的基本规律,为进一步研究VoD系统的服务性能提供了理论依据.     

乳腺癌p16和p53蛋白的表达及意义

目的　探讨p1 6蛋白和p53蛋白在乳腺癌中的表达及意义。方法　应用免疫组化ABC法检测了 74例乳腺癌 p1 6蛋白和p53蛋白的表达情况。结果　 74例乳腺癌 p1 6蛋白阳性表达率43 2 % ;在不同组织学分级的乳腺癌中p1 6蛋白阳性率分别为Ⅰ级 1 1 1 % ,Ⅱ级 50 % ,Ⅲ级 44 8% ,其各组间差异无统计学意义 (P >0 0 5)。 74例乳腺癌p53蛋白的阳性率为 44 6% ;p53蛋白阳性表达与乳腺癌组织学分级明显相关 ,其阳性率分别为Ⅰ级 2 2 2 % ,Ⅱ级 30 6% ,Ⅲ级 69 0 % ,Ⅲ级明显高于Ⅰ级 (P <0 0 1 )和Ⅱ级 (P <0 0 1 )。乳腺癌 p1 6蛋白与p53蛋白表达之间无明显相关。结论　p1 6蛋白的失表达 ,突变型p53蛋白的过表达均与乳腺癌发生发展有关 ,它们通过不同途径发挥生物学作用 ,p53蛋白表达对评估乳腺癌的分化程度和判断预后具有一定价值。     

p21WAF1/CIP1基因及p53蛋白在大肠癌的表达及意义

用免疫组织化学方法对 4 2例大肠癌组织 p2 1WAF1/ CIP1基因及 p53蛋白的表达进行检测。结果表明 :p2 1WAF1/ CIP1阳性率 4 2 .9% ,p53蛋白阳性率 6 4 .1% ;两者与大肠癌的组织分化、淋巴结转移及术后生存率之间有关 ,并随着肿瘤恶性程度的增加 ,p2 1WAF1/ CIP1阳性率下降 ,p53蛋白阳性率增加。推测 p2 1WAF1/ CIP1及 p53之间存在着一定的负性相关关系 ,同时检测 p2 1WAF1/CIP1基因及 p53蛋白的表达情况 ,有助于判断大肠癌的生物学行为及患者的预后。     

血清miR-21在诊断宫颈磷癌淋巴结转移中的价值

目的研究血清miR-21在诊断宫颈磷癌淋巴结转移方面的价值。方法选择2011年1月～2011年9月在广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科住院接受治疗的80例患者为研究对象,其中宫颈癌伴淋巴结转移者25例,不伴淋巴结转移者40例,正常对照组15例。治疗前留取患者血清,实时荧光定量PCR测定血清miR-21水平,Spearman秩相关分析血清miR-21水平与患者淋巴结转移的关系,绘制受试者工作曲线(ROC),计算血清miR-21的诊断界值。结果宫颈癌伴淋巴结转移患者血清miR-21水平较不伴淋巴结转移患者和正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-21水平与宫颈癌淋巴结转移呈正相关(r=0.408,P<0.001);血清miR-21在宫颈癌确诊病例中诊断淋巴结转移的ROC下面积为0.770,最大约登指数0.485,相应灵敏度56%,特异度92.5%,对应诊断界值6.65。结论血清miR-21在诊断宫颈癌淋巴结转移方面可能有一定的临床价值和应用空间。     

p57kip2和p21cip1在人脑胶质瘤中的表达和临床意义

目的探讨p57kip2蛋白、p21cip1蛋白在人脑胶质瘤中的表达情况及其临床意义。方法采用免疫组织化学SP法检测p57kip2、p21cip1在55例人脑胶质瘤和10例正常脑组织中的表达。结果在55例胶质瘤中,p57kip2蛋白阳性率为38.2%(21/55),显著低于正常脑组织的80%(8/10)(P=0.036)。p57kip2蛋白表达在低度恶性(Ⅰ-Ⅱ级)组显著高于高度恶性(Ⅲ-Ⅳ级)组(P=0.029),生存时间≥2年组显著高于<2年组(P=0.032)。脑胶质瘤中p21cip1蛋白阳性率为60.0%(33/55),与正常脑组织的90.0%(9/10)相比,差异无统计学意义(P=0.143)。p21cip1蛋白表达在高度恶性(Ⅲ-Ⅳ级)组显著低于低度恶性(Ⅰ-Ⅱ级)组(P=0.047),生存时间<2年组显著低于≥2年组(P=0.002)。p57kip2蛋白的表达与p21cip1蛋白的表达存在正相关(rs=0.354,P=0.008)。结论p57kip2蛋白和p21cip1蛋白在脑胶质瘤中存在异常表达,p57kip2蛋白和p21cip1蛋白的表达程度与脑胶质瘤的分化程度、预后相关。     

miR-185*对癫痫海马神经元中BDNF-TrkB通路表达的影响

目的研究海马神经元癫痫模型中的BDNF/TrkB信号通路及miR-185*对其的调控。方法构建miR-185*表达载体。体外培养海马神经元,7d后将其随机分为正常组、癫痫组、正常+BDNF组、癫痫+BDNF组、正常转染miR-185*组、癫痫转染miR-185*组、癫痫转染miR-185*+BDNF组。免疫荧光、膜片钳及免疫印迹技术观察转染miR-185*后BDNF/TrkB通路的表达变化。结果癫痫+BDNF组海马神经元细胞的TrkB蛋白磷酸化水平较正常+BDNF组降低,有统计学意义(P<0.05);正常+BDNF组TrkB蛋白的磷酸化水平比正常组的磷酸化水平升高,有统计学意义(P<0.001);癫痫+BDNF组TrkB蛋白磷酸化水平比癫痫组升高,有统计学意义(P<0.05);而癫痫+miR-185*+BDNF组的TrkB蛋白磷酸化水平较癫痫+BDNF组和癫痫转染miR-185*组升高(P<0.001)。结论BDNF可以激活BDNF/TrkB信号通路,转染miR-185*后可以消除对癫痫状态下BDNF/TrkB信号传导通路的抑制。     

miR-199a-3p靶基因预测及生物信息学分析

目的为深入研究miR-199a-3p在膀胱癌形成和发展中的作用提供理论依据。方法分析miR-199a-3p序列,预测其靶基因和转录因子,并对靶基因进行GO富集和KEGG Pathway分析;构建TF-miR-199a-3p-靶基因网络调控图。结果 miR-199a-3p序列在多物种间具有高度保守性;GO分析发现miR-199a-3p的靶基因参与细胞调节、代谢调节、细胞大分子生物合成等生物过程(P<0.01);KEGG Pathway分析发现miR-199a-3p的靶基因显著富集在上皮细胞的细菌入侵通路、ECM受体的相互作用通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、小细胞肺癌通路、癌症中的蛋白聚糖通路等;根据构建的TF-miR-199a-3p-靶基因网络调控图,挖掘出可能受miR-199a-3p调控的重要基因有MYC、SP1、mTOR、NFκB、NFκB1等。结论 miR-199a-3p可能通过直接靶向作用mTOR,调节PI3K-Akt-mTOR信号通路,从而参与膀胱癌的形成和发展。     

食管鳞癌组织中脾酪氨酸激酶及p53基因的表达及临床病理意义

目的 研究食管鳞状上皮细胞癌(简称食管鳞癌)组织中脾酪氨酸激酶(Syk)及p53基因的表达及二者的关系,并探讨其与食管鳞癌发生及发展的相关性.方法 用快捷免疫组化法及RT-PCR法检测食管鳞癌组织及其对应癌旁组织中Syk蛋白及mRNA的表达,同时检测p53蛋白及mRNA的表达,分析食管鳞癌中上述2个基因表达变化的相关性...