放射损伤对小鼠骨髓间充质干细胞成骨潜能及造血干细胞龛位的影响

目的 观察放射对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)体外成骨潜能及体内骨髓造血干细胞(hematologic stem cells, HSCs)龛位的影响.方法 分离、培养正常及接受4 Gy放射后不同时间点小鼠BMMSCs,用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色法和实时定量RT-PCR检测成骨分化相关基因,鉴定BMMSCs体外成骨分化潜能的改变,并通过骨组织形态学和免疫组织化学的方法检测放射后小鼠体内成骨细胞及纺锤形的、表达神经钙黏附分子的成骨细胞(spindle-shaped N-cadherin-expressing osteoblasts, SNOs)数量的变化.结果 全身照射(total body irradiation, TBI)后早期小鼠BMMSCs的成骨潜能增强,但随后迅速降低;TBI后28 d小鼠骨髓中成骨细胞和SNOs的数量均显著减少.结论 4Gy放射损伤后远期小鼠BMMSCs的成骨潜能显著降低,体内HSCs龛位也明显缩小.     

非血缘异基因造血干细胞移植治疗白血病21例临床观察

目的观察非血缘异基因造血干细胞移植治疗白血病的临床疗效及并发症。方法回顾性分析21例非血缘异基因造血干细胞移植的恶性血液病患者临床资料,其中19例为外周血造血干细胞移植,1例为骨髓移植,1例为脐血移植。HLA全相合8例,HLA不全相合13例。回输单个核细胞(MNC)中位数9.078×108/kg,CD34+细胞中位数4.62×106/kg。10例患者采用BuCy方案预处理,9例采用改良的BuCy2方案预处理,1例采用非清髓的BuCy+氟达拉滨的方案,1例采用TBI+VP-16+CTX+meCCNU预处理。预防移植物抗宿主病方案,其中20例采用短程甲氨蝶呤+环孢素A+霉酚酸酯+抗胸腺细胞免疫球蛋白的四联方案,1例脐血移植患者采用短程甲氨蝶呤+环孢素A+抗胸腺细胞免疫球蛋白。术后观察受者的造血重建、并发症以及预后情况。采用低剂量肝素+前列腺素E1+丹参注射液预防肝静脉闭塞病(VOD)。结果除1例患者于空髓期死于颅内出血,其余20例患者均获造血重建。高剂量组MNC及CD34+细胞较低剂量组中位重建时间平均缩短1d。预处理中出现高热、寒战、胃肠道副反应、肝脏损伤及口腔黏膜炎等副反应,均给予对症处理后好转。HLA不合者较HLA全相合者移植后移植物抗宿主病(GVHD)发生率高,差异有统计学意义。9例患者出现aGVHD(Ⅰ度3例,Ⅱ度4例,Ⅲ度2例);9例出现cGVHD,表现为皮肤及肝脏受损,经有效治疗后好转。术后100d内18例受者出现细菌或真菌感染,以上呼吸道感染为主,7例发生巨细胞病毒感染,2例出现EB病毒血症,1例出现尿BK病毒感染。1例患者因VOD死亡,其余患者均未发生VOD。5例发生Ⅱ级至Ⅲ级出血性膀胱炎,经治疗后均好转。受者总的中位生存时间为24月(136d~9年),1年及3年总生存率分别为85.2%和63.9%,无病生存率分别为81.0%和23.8%,无复发生存率为71.4%和14.3%。结论非血缘异基因造血干细胞移植是治疗白血病的有效方法;BuCy及改良BuCy2的预处理方案均安全有效,毒性反应可逆、可耐受;高剂量MNC及CD34+细胞数组造血重建时间较低剂量组缩短;HLA不全相合者移植后GVHD发生率较HLA全相合者增高;低剂量肝素+前列腺素E1+丹参注射液可有效预防VOD。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察

目的　分离和培养大鼠骨髓组织中的间充质干细胞 ,并观察其生长形态。方法　利用造血干细胞和骨髓间充质干细胞不同生长特性 ,采用贴壁法分离并用含 15 % (体积分数 )FBS的低糖型DMEM培养基培养。结果　分离培养得到的细胞中随着换液次数的增加红细胞和造血细胞逐渐减少 ;骨髓组织中贴壁得到间充质干细胞呈梭形、纺锤形和多角形。结论　贴壁法可以分离培养骨髓中的间充质干细胞     

供者HBV感染对异基因造血干细胞移植受者的影响

目的观察供者乙肝病毒(HBV)感染对异基因造血干细胞移植受者的影响。方法回顾性分析我院2015年1月至2016年12月期间行异基因造血干细胞移植的4例非乙肝患者,其供者均有HBV感染。观察应用HBV感染供者的外周血造血干细胞进行移植,移植后对受者造血重建、肝静脉闭塞病(VOD)以及HBV感染的影响。结果 4例供者中2例供者为乙肝血清学HbsAb、HbeAb及HbcAb阳性,HBV-DNA定量阴性,供受者均未应用抗HBV药物。1例供者为HbsAg、HbeAb及HbcAb阳性,HBV-DNA定量阳性;1例供者HbsAg及HbcAb阳性,HBV-DNA定量阳性。这2例供者移植前1个月开始口服核苷类药物治疗,移植前HBV-DNA定量转为阴性,受者预处理前1周开始口服核苷类药物预防HBV感染,回输干细胞当天及回输后第3天及第7天均给予乙肝免疫球蛋白,移植后每月复查HbsAb定量,低于150IU给予输注乙肝免疫球蛋白。4例患者移植后均造血重建,无1例发生VOD,截止随访结束均无HBV感染,监测HBV-DNA定量阴性。结论对于HBV复制的供者及其受者口服核苷类抗HBV药物联合乙肝免疫球蛋白可以有效预防受者HBV感染。     

"氟达拉滨+马利兰"预处理异基因造血干细胞移植治疗白血病的临床观察

目的 探讨使用"氟达拉滨+马利兰(Flud+Bu)"预处理方案行异基因造血干细胞移植治疗白血病的临床疗效.方法 6例患者中,慢性粒细胞白血病(CML)慢性期2例,急性淋巴细胞白血病(L2型)2例,急性非淋巴细胞白血病(M5型)1例,骨髓增生异常综合征(MDS)转化急非淋白血病1例.预处理方案包括氟达拉滨30mg/(m2·d)×4d,注射用马利兰3.2mg/(kg·d)×2～4d;非血缘移植患者加用兔抗人胸腺细胞球蛋白(ATG)2.5mg/(kg·d)×3d;供者为其HLA配型相合的同胞或非血缘;输注外周血造血干细胞数合计CD34+细胞3.0～8.03×106/kg(平均4.29×106/kg),单个核细胞6.74～13.51×108/kg(平均9.01×108/kg);采用"环孢霉素+短疗程甲氨喋呤"预防移植物抗宿主病(GVHD).结果所有患者均未发生严重的预处理相关并发症;其中5例患者重建造血,检测外周血白细胞STR-DNA证实均为完全供者植入;1例急淋L2患者在移植后早期(<30d)白血病复发导致死亡,其余5例患者随访8～20个月(中位时间10个月)均存活,至今无白血病复发.结论 "氟达拉滨+马利兰"预处理方案移植相关并发症轻,治疗恶性血液病安全可行,远期疗效尚待评估.     

FAC联合Bu改良预处理方案对重型再生障碍性贫血患者移植疗效的影响

目的 观察FAC联合Bu改良预处理方案对重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia, SAA)异基因造血干细胞移植疗效的影响。方法 收集我院2016年1月至2021年9月期间收治的行异基因造血干细胞移植的28例SAA患者的临床资料,按照预处理方案不同将患者分为两组：FAC方案预处理组和FAC+Bu预处理组,观察两组患者预处理的毒副反应、造血植入、移植后急慢性移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)、病毒感染、肝静脉闭塞病(VOD)发生率及无进展生存期(progression free survival, PFS)、总体生存期(overall survival, OS)的差异。结果 两组患者在年龄、性别、体能状况、患病距离移植时间、供受者性别关系、移植类型、输注骨髓有核细胞、单个核细胞(mononuclear cell, MNC)及CD34⁺细胞之间差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。与FAC组相比,FAC+Bu组患者预处理后幻听幻视副反应增加,移植后混合嵌合发生率降低,血小板重建时间缩短...     

不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的 观察不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞(adiposE-derived stromal cells, ADSCs)生物学特点与年龄的关系,为临床寻找理想的种子细胞并迅速获取所需ADSCs提供实验依据.方法 使用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,分析脂肪间充质干细胞的纯度,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期.结果 不同年龄段ADSCs均贴壁生长,呈典型ADSCs形态和生长特征,传代细胞的增殖速度比原代细胞快,但随着年龄的增长,原代及传代培养ADSCs的增殖能力下降,生长周期延长.结论 ADSCs的增殖能力和活性随着年龄的增长而降低,但各年龄段ADSCs均可满足临床不同患者组织工程种子细胞的要求.     

体内心肌缺血微环境下大鼠骨髓间充质干细胞钾离子通道的表达

目的动态观察在体内心肌缺血微环境下,大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞分化过程中主要钾离子通道的分化表达。方法采用左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)结扎术建立大鼠急性心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型(n=60),将绿色荧光蛋白(green fluorescent pro-tein,GFP)标记的MSCs,心外膜下注射移植到心肌梗死周边区;免疫荧光染色观察移植后3d(MI-3d组)、5d(MI-5d组)、7d(MI-7d组)、9d(MI-9d组)MSCs的存活情况及其主要钾离子通道(Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3、Kca1.1)蛋白的表达;应用激光捕获显微切割技术分离以上各组心肌组织中GFP标记的MSCs群,应用Real-time PCR测定其Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3、Kca1.1的mRNA表达。结果免疫荧光染色观察到移植的MSCs于移植后第3天开始持续表达Kv1.4、Kir2.1、Kv4.3,不表达Kca1.1,于移植后第9天几乎未观察到MSCs;Real-time PCR结果显示移植后3、5、7d,移植的MSCs上Kv1.4和Kir2.1表达呈逐步增多趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),Kv4.3的表达无此变化趋势,但高于未移植MSCs,未见明显差异。结论移植的MSCs在大鼠体内心肌缺血微环境下向心肌细胞分化的过程中能够表达部分钾离子通道表型,但其不能长时间、有效的存活。     

大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化中碱性磷酸酶的变化

目的　研究大鼠骨髓间充质干细胞药物诱导定向成骨细胞分化特性及分化过程中碱性磷酸酶的变化。方法　用质量浓度为 1.0 73kg·L-1的Percoll分离骨髓间充质干细胞 ,再连续进行 3次换液以纯化骨髓间充质干细胞。加药物 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化。在加药后 5、10、15、2 0d用比色法检测细胞中碱性磷酸酶含量。改良Gomori染色 ,统计阳性细胞百分率。结果　梯度密度离心和黏附贴壁法联合使用可得到均一的骨髓间充质干细胞。用比色法测得在第 5、10、15、2 0d ,碱性磷酸酶含量 (A40 5)分别为 0 .391± 0 .0 2 14、0 .4 345± 0 .0 2 31、0 .8781± 0 .0 2 96和 0 .933± 0 .0 2 36 ;对照组为 0 .16 5 6± 0 .0 2 4 2、0 .15 2 8± 0 .0 2 15、0 .14 5 3± 0 .0 2 0 4和 0 .14 35± 0 .0 2 16。同时期改良Gomori染色阳性细胞率分别为 10 .35 %、11.4 8%、35 .2 8%和 4 6 .7%。结论　大鼠骨髓间充质干细胞经药物诱导后可以分化成成骨细胞。在分化过程中碱性磷酸酶含量从给药后的 10d左右才开始显著升高。在此过程中改良Gomori染色结果与其保持一致     

非血缘异基因造血干细胞移植后出血性膀胱炎病例分析

目的探讨非血缘异基因造血干细胞移植后并发出血性膀胱炎的治疗策略。方法对2009年至2012年在西安交通大学医学院第一附属医院血液科行非血缘异基因造血干细胞移植患者中发生迟发型出血性膀胱炎的8例病例进行回顾分析。结果 7例患者经水化、碱化尿液、强迫利尿,抗病毒,甲强龙治疗后痊愈;1例患者常规及抗病毒治疗效果不佳,经持续膀胱冲洗和药物膀胱灌注后好转。结论出血性膀胱炎是造血干细胞移植的常见并发症,水化、碱化尿液及抗病毒治疗的同时,应尽早加用激素控制病情,膀胱冲洗和药物灌注也是有效的治疗手段。     

早期人胚神经干细胞分布及分离培养

目的　研究发育早期人胚脑神经干细胞的形态特征及其分布情况 ,并观察其体外生长分化特性。方法　计划生育流产的 6～ 12周胚胎大脑组织切片用vimentin抗体进行免疫组织化学染色 ,光镜观察。机械分离皮质细胞 ,用无血清培养基和含血清培养基进行悬浮和贴壁培养 ,分别用MAP2 、GFAP及GalC抗体进行免疫细胞化学染色 ,鉴定干细胞和神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结果　发育早期大脑Vimentin阳性细胞分布广泛 ,细胞形态单一 ,多呈圆球形 ,体积较小。体外培养的大脑皮质细胞在培养的第 5～ 7天时 ,形成较多克隆 ,可多次传代 ;贴壁培养时细胞发生分化 ,分别为MAP2 、GFAP、GalC阳性的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论　胚胎发育早期大脑神经干细胞分布广泛 ,形态单一 ,皮质Vimentin阳性细胞数量多 ,便于分离 ,是最佳神经干细胞分离部位 ;人NSCs可以在体外增殖并发生多向分化     

神经干细胞的分离培养与鉴定

目的　分离培养新生鼠神经干细胞并获得细胞克隆 ,同时建立良好的传代方法。方法　取新生大鼠大脑室管膜、脑室周围及海马细胞 ,经消化及机械吹打后接种于加有N2添加剂及生长因子的DMEM/F12 培养基 ,悬浮培养 ;用含血清而不含生长因子的培养基贴壁培养 ,促使分化 ;最后用免疫细胞化学方法进行染色鉴定。结果　分离培养的细胞多聚集生长 ,并形成细胞克隆 ,可以传代 ;细胞为圆形或椭圆形 ,经鉴定为nestin抗原阳性 ;分化后细胞分别表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论　分离培养的细胞具有自我更新和多向分化能力 ,表达神经干细胞的特异性抗原nestin ,是神经系统的干细胞。     

14周至足月胎儿角膜上皮干细胞的分布及超微结构观察

目的观察胚胎期角膜上皮干细胞的迁移规律及其超微结构,为利用胎儿角膜上皮干细胞提供理论依据。方法观察14至38周胎儿角膜上皮HE及抗人64ku角蛋白单克隆抗体(mAE5)染色反应,并观察胎儿角膜上皮干细胞的超微结构。结果14周角膜上皮由一层基底细胞被覆一至两层鳞状细胞构成,且仅有表层鳞状细胞mAE5弱阳性反应。17至29周缘部上皮有3~5层,中央部有2~3层,整层基底细胞mAE5反应阴性,其上鳞状细胞呈强阳性。33至38周角膜上皮已近成熟,仅剩缘部基底上皮细胞mAE5反应阴性。超微结构显示mAE5阴性反应的基底层细胞核异染色质多,胞质中细胞器较少,且细胞间连接也较少。结论胎儿角膜上皮干细胞呈现由全层向基底层,再向缘部逐渐迁移的分布规律,且超微结构较幼稚。     

豚鼠骨髓间充质干细胞培养及成骨细胞定向分化

目的　分离和培养豚鼠骨髓间充质干细胞 ,研究其成骨细胞分化特性。方法　采用成年豚鼠用贴壁法分离骨髓间充质干细胞并传代培养。取第三代培养细胞做细胞生长曲线测定。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导使其向成骨细胞分化。Gomori钙钴法作碱性磷酸酶染色。结果　全培养骨髓细胞 ,连续 3d换液后能得到均一的骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞群体倍增时间为 6 1h。用 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导可以使其成骨细胞分化。碱性磷酸酶染色阳性。结论　贴壁法可用于分离骨髓间充质干细胞。豚鼠骨髓间充质干细胞具有药物诱导定向成骨细胞分化的特性     

胰岛干细胞的研究现状与展望

详细介绍了胚胎干细胞和成体干细胞向胰岛干细胞转化的诱导分化方法及可能途径,用于胰岛干细胞鉴定的基因分子标志及胰岛干细胞促分化因子。并简要介绍了胰岛干细胞治疗糖尿病的研究现状及存在的问题。     

乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化及血管形成的实验研究

目的探讨乳腺癌干细胞向血管内皮细胞分化的潜力及参与肿瘤血管形成的作用。方法收集人乳腺癌组织样本,检测肿瘤血管中突变型P53、CD31、VEGF的表达及Her-2扩增;制备乳腺癌单细胞悬液,分选出CD44~+/CD24-/low细胞,以培养体系为EGM-2内皮细胞培养基培养,检测其内皮细胞表面标志CD31和CD105的表达和摄取乙酰化低密度脂蛋白的能力,体外进行三维胶培养,观察其脉管样结构。结果乳腺癌组织样本中均可观察到CD31、VEGF、突变型P53的表达,并沿着血管腔或血管球排列;免疫荧光显示乳腺癌组织血管内表达CD31和DAPI信号;在13例所取样本中检测到Her-2阳性扩增4例,未扩增9例。分离成功的乳腺癌干细胞进行免疫磁珠分选,分选前CD44~+细胞比例[(7.5±2.6)%]明显低于分选后[(94.3±4.7)]%,差异具有统计学意义(P<0.05);分选前CD24~+细胞比例[(48.2±9.4)%]明显高于分选后[(4.3±1.6)%],差异具有统计学意义(P<0.05)。乳腺球细胞中CD105~+细胞比例为(4.5±0.9)%,CD31~+细胞比例为(6.2±1.3)%;经内皮细胞培养体系持续培养3代后,CD105~+和CD31~+细胞比例分别为(79.6±9.3)%和(84.1±10.7)%,差异有统计学意义(P<0.05)。经内皮细胞培养体系培养后的细胞能吞噬DiL-Ac-LDL,内皮细胞组可见有脉管样结构形成,而对照组无脉管样改变的趋势。结论乳腺癌干细胞来源的内皮细胞可分化为血管内皮细胞并具有脉管形成的能力,提示乳腺癌干细胞可能参与肿瘤血管的形成。     

人鼻咽癌放射抗拒性肿瘤干细胞的分离、筛选与鉴定

目的分离、筛选、鉴定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的肿瘤干细胞。方法免疫磁珠技术分选CNE-2及CNE-2R中鼻咽癌CD133+干细胞,分别用无血清培养法、平板克隆法、裸鼠成瘤试验检测分选的CD133+细胞体外增殖能力、克隆形成能力及成瘤能力,HE染色和电镜超微结构观察形态学变化。结果 CNE-2及CNE-2R细胞中CD133+表达分别为(1.79±0.16)%和(2.63±0.72)%;CNE-2-CD133+细胞及CNE-2R-CD133+细胞形成肿瘤干细胞球及体外增殖能力远高于CD133-表达者;CNE-2R-CD133+细胞克隆形成能力较CNE-2-CD133+细胞明显升高,而且CNE-2R-CD133+细胞的克隆形态与CNE-2-CD133+细胞相比较明显增大;形态学发现CNE-2R-CD133+细胞核大,异型,核仁大,细胞器肥大。结论分离、筛选出的鼻咽CNE-2R-CD133+肿瘤干细胞能形成干细胞球,其增殖能力、裸鼠成瘤能力更强,能为进一步探讨鼻咽癌放射抗拒的机制提供研究基础。     

子宫内膜基质干细胞的体外成骨诱导和成脂诱导分化

目的探讨子宫内膜基质干细胞的多向分化潜能。方法取因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的子宫内膜组织,磁珠分选子宫内膜基质干细胞,进行传代培养。传代细胞分别加入成骨诱导剂和成脂诱导剂培养,并通过茜素红和油红O染色对成骨细胞和脂肪细胞形态进行鉴定。结果子宫内膜基质干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,其经成骨、成脂诱导培养3周后形态、体积发生明显改变。茜素红染色显示细胞团中央能形成钙化结节;成脂诱导后油红O染色可见细胞质内出现橙红色脂滴。结论子宫内膜基质干细胞经体外诱导培养后可向成骨细胞和脂肪细胞分化,并具有明显的成骨和成脂细胞形态,表明子宫内膜基质干细胞具有多向分化潜能。     

小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定

目的建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells,GNCSCs)的方法,为临床应用奠定基础。方法分离胚鼠肠管,消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基,贴壁培养;连续传代后用血清促进GNCSCs分化;最后用免疫细胞化学方法染色鉴定。结果分离培养的细胞聚集生长,形成的克隆球可以传代;克隆球p75染色阳性;分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原。结论分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力,表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75,是肠神经嵴干细胞。