c-Jun氨基末端激酶信号通路参与电刺激大鼠三叉神经节偏头痛模型降钙素基因相关肽表达调控

目的探究c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-Terminal Kinase,JNK)信号转导通路对电刺激大鼠三叉神经节(TG)偏头痛模型中降钙素基因相关肽(CGRP)表达调控的作用。方法成年雄性SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组、DMSO+模型组、SP50+模型组、SP25+模型组。采用电刺激大鼠单侧TG制作偏头痛模型,选择JNK信号通路特异性阻滞剂SP600125为干预药物。观察偏头痛造模前后的行为学变化。各组大鼠处理后24h,Western blot检测TG中磷酸化JNK蛋白(p-JNK)和JNK蛋白表达量并计算磷酸化比率,免疫组织化学染色检测CGRP表达量。结果大鼠造模后前肢挠头次数增加、爬笼次数减少(P<0.05)。模型组、假手术组、DMSO+模型组、SP25+模型组大鼠TG内p-JNK比率较空白对照组明显升高(P<0.05);SP50+模型组TG内p-JNK比率较模型组、SP25+模型组明显降低(P<0.05);模型组TG内CGRP表达量较空白对照组、SP50+模型组明显升高(P<0.05);模型组刺激侧TG内CGRP表达量明显高于未刺激侧。结论电刺激大鼠单侧TG可使偏头痛急性发作过程中关键的神经血管活性肽CGRP表达升高,引发大鼠行为学变化,且JNK信号通路参与了TG内CGRP的表达调控过程。     

全脑缺血再灌注损伤后JUN蛋白在大鼠海马的表达及热休克预处理对其表达的影响

目的研究全脑缺血再灌注损伤后JUN蛋白在大鼠海马的表达及热休克预处理对其表达的影响。方法以四血管法建立全脑缺血再灌注模型。将大鼠置于42℃中15 min行热休克预处理,全脑缺血6 min后行2 h、6 h、12 h、24 h3、d、5 d再灌注后处死,取海马脑组织行HE染色、JUN蛋白免疫组化染色,TUNEL法检测凋亡细胞。结果缺血再灌注后2 h JUN蛋白在CA1区开始表达,6 h达到高峰,5 d时仍有表达;CA3区JUN蛋白的表达弱于CA1区(P<0.05);同时CA1区细胞损伤明显。热休克预处理组JUN蛋白表达在CA1和CA3区相应时点减弱(P<0.05),细胞损伤轻微,凋亡细胞减少(P<0.05)。结论全脑缺血再灌注损伤后JUN蛋白过度表达参与了神经元损伤过程,热休克预处理通过下调JUN蛋白过度表达具有脑保护作用。     

姜黄素对沙土鼠脑缺血再灌注后海马CA1区及CA3区Bcl-2、Bax表达的影响及意义

目的探讨姜黄素对沙土鼠脑缺血再灌注后凋亡相关基因Bcl-2、Bax在海马CA1区、CA3区表达的影响及意义。方法制作沙土鼠双侧颈总动脉阻断缺血再灌注损伤模型。随机分为假手术组(SH)、脑缺血再灌注组(IR)、姜黄素组(CU)、对照组(SC),每组据再灌注时间点不同又分为1、3、57、d 4个亚组,每组6只动物。在预定时间点行开阔法行为学检查,TUNEL法检测海马CA1区、CA3区细胞凋亡,免疫组织化学染色测定Bcl-2、Bax蛋白在海马CA1区、CA3区的表达变化。结果姜黄素可显著减少沙土鼠探索活动及海马CA1、CA3区凋亡锥体细胞数量(与IR组相比,P<0.01),诱导Bcl-2蛋白及抑制Bax蛋白表达(与IR组相比,P<0.01)。结论姜黄素有脑保护作用,调控凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达可能是其作用机制之一。     

姜黄素对沙土鼠脑缺血再灌注后海马CAl区及CA3区Bcl-2、Bax表达的影响及意义

目的探讨姜黄素对沙土鼠脑缺血再灌注后凋亡相关基因Bcl-2、Bax在海马CA1区、CA3区表达的影响及意义。方法制作沙土鼠双侧颈总动脉阻断缺血再灌注损伤模型。随机分为假手术组（SH）．脑缺血再灌注组（IR）、姜黄素组（CU）、对照组（SC），每组据再灌注时间点不同又分为1、3、5、7d4个亚组，每组6只动物。在预定时间点行开阔法行为学检查，TUNEL法检测海马CA1区、CA3区细胞凋亡，免疫组织化学染色测定Bcl-2、Bax蛋白在海马CA1区、CA3区的表达变化。结果姜黄素可显著减少沙土鼠探索活动及海马CA1、CA3区凋亡锥体细胞数量（与IR组相比，P〈0．01），诱导Bcl-2蛋白及抑制Bax蛋白表达（与IR组相比，P〈0．01）。结论姜黄素有脑保护作用，调控凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白的表达可能是其作用机制之一。     

P38MAPK通路对脑缺血后处理大鼠海马自噬的影响

目的探讨脑缺血后处理通过P38MAPK通路调控自噬减轻脑缺血再灌注损伤的机制。方法采用改良的Pulsinelli四血管闭塞(4-VO)法制作脑缺血模型,随机将128只雄性SD大鼠平均分为4组:假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注模型组(CIR组)、脑缺血后处理组(CIP组)、脑缺血后处理+P38MAPK抑制剂组(SB203580组),每组再分为6、24、48、72h四个时间点。应用HE染色观察海马CA1区各时间点神经元的形态及存活神经细胞数量;免疫组织化学染色法测定海马CA1区磷酸化P38MAPK和自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达;Western blotting法检测海马组织磷酸化P38MAPK和自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的蛋白含量。结果与Sham组比较,CIR组大鼠海马CA1区神经元结构破坏,各时间点存活神经元数量下降,磷酸化P38MAPK表达增加,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达增加;与CIR组比较,CIP组和SB203580组神经元结构改善,各时间点存活神经元数量增加,磷酸化P38MAPK各时间点表达水平下降,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达增加;与CIP组比较,SB203580组海马CA1区神经元结构明显改善,各时间点存活神经元数量增加,磷酸化P38MAPK各时间点表达水平下降,LC3-Ⅱ、Beclin-1表达增加。结论脑缺血后处理可能通过抑制P38MAPK通路调控自噬,发挥其神经保护作用。     

观察脑啡肽在大鼠缺血再灌注脑组织中的表达特点

目的观察大脑中动脉缺血再灌注大鼠脑皮层和海马CA1区脑啡肽的表达,探讨缺血时间和再灌注时间的改变对脑啡肽含量、分布的影响。方法 56只雄性SD大鼠,随机分为7组,通过线栓法制作双侧大脑中动脉栓塞大鼠模型,在预定的时间点取脑组织固定,进行免疫组化及免疫荧光染色评估脑组织中脑啡肽的表达。结果假手术组与实验组皮层、海马CA1区均可见脑啡肽阳性表达及脑啡肽阳性细胞。实验组皮层及海马CA1区脑啡肽的含量与假手术组比较从再灌注8h后开始增加,24h增加明显,且缺血100min组脑啡肽含量较缺血30min组增加明显(P<0.05)。实验组海马CA1区阳性细胞数与假手术组比较无明显差异(P>0.05),皮层内脑啡肽阳性细胞数实验组在再灌注8h开始增加,24h增加明显,且缺血100min组脑啡肽阳性细胞数较缺血30min组增加明显(P<0.05)。结论皮层和海马CA1区脑啡肽的表达随缺血时间和再灌注时间延长而增加;皮层内脑啡肽表达的增加既包括脑啡肽总含量的增加,也包括脑啡肽阳性细胞数的增加,而海马CA1区仅仅表现为脑啡肽总含量的增加。     

利多卡因对脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织细胞间黏附分子-1及核转录因子-κB表达的影响

目的观察利多卡因对大鼠脑缺血再灌注损伤后海马组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及核转录因子-κB(NF-κB)蛋白和mRNA表达的影响,探讨利多卡因脑保护作用的机制。方法雄性SD大鼠32只,随机分为假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)、利多卡因小剂量组(C组)和利多卡因大剂量组(D组),缺血前10 min腹腔注射。脑缺血10 min再灌注24 h时,断头处死大鼠。用RT-PCR技术检测海马组织ICAM-1及NF-κB mRNA的表达,用免疫组织化学、蛋白印记(Western blot)方法检测ICAM-1及NF-κB蛋白表达情况。结果脑缺血再灌注后海马组织ICAM-1和NF-κB mRNA及蛋白表达水平增高,利多卡因可下调ICAM-1及NF-κB表达;缺血再灌注后,海马区神经元出现明显坏死,利多卡因可减轻海马区神经元损伤。结论利多卡因可能通过抑制ICAM-1与NF-κB基因表达而对脑缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。     

参芎化瘀胶囊通过VEGF/Notch1信号通路改善大鼠缺血性脑卒中损伤

目的探讨参芎化瘀胶囊对全脑缺血再灌注损伤大鼠的治疗作用及对海马区VEGF/Notch1通路的影响。方法 SD大鼠分为假手术组、模型组及参芎化瘀胶囊高、低剂量组。采用改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法制作全脑缺血模型,分别在缺血24、48、72h应用光镜观察海马区神经细胞形态的变化;应用免疫组化法检测海马区VEGF、Notch1表达。结果与假手术组比较,模型组海马区各时间点的存活神经细胞率降低,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF、Notch1表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,参芎化瘀胶囊组各时间点的存活神经细胞率增加,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF、Notch1表达进一步升高,差异有统计学意义(P<0.05)。上述变化在高剂量参芎化瘀胶囊组更为明显。模型组VEGF与Notch1表达呈正相关(r=0.846,P<0.01);参芎化瘀胶囊组VEGF与Notch1表达呈正相关(r=0.814,P<0.01)。结论参芎化瘀胶囊对脑缺血损伤有很好的治疗作用,其机制可能与调控VEGF/Notch1信号途径有关。     

Toll样受体4在蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤中的作用及对海马区神经元自噬的影响

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)大鼠早期脑损伤中的作用及其对海马CA1区神经元自噬的影响。方法 192只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、SAH模型组(模型组)、SAH+DMSO溶剂组(溶剂组)、SAH+TLR4抑制剂组(CLI-095组),每组再依据取材时间不同分为24 h和48 h两个时间点。采用颈内动脉穿刺法建立SAH模型,溶剂组与CLI-095组在制备SAH模型前侧脑室分别注射DMSO溶液10μL或100μg/mL的CLI-095溶液10μL。Garcia评分检测大鼠行为学改变;干湿重法检测脑水肿情况;HE染色观察海马CA1区神经元形态;免疫组化和免疫印迹法检测大鼠海马CA1区TLR4、LC3和Beclin1蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组各时间点Garcia评分均降低(P<0.05),脑水肿程度加重,存活神经元数量减少(P<0.05),海马CA1区TLR4、LC3及Beclin1表达增多(P<0.05)。与模型组比较,CLI-095组各时间点Garcia评分增多(P<0.05),脑水肿程度减轻,存活神经元数量增多(P<0.05),海马CA1区TLR4、LC3及Beclin1表达降低(P<0.05)。结论 TLR4可能通过调控SAH诱导的自噬,参与并加重SAH继发性脑损伤的过程。     

ERK信号通路抑制剂U0126对蛛网膜下腔出血大鼠早期脑损伤及神经元自噬的影响

目的探讨ERK信号通路特异性抑制剂U0126对蛛网膜下腔出血(SAH)对早期脑损伤及海马区神经细胞自噬的作用。方法成年雄性SD大鼠48只,随机数字表法分为对照组、SAH组、DMSO+SAH(二甲基亚砜)组、U0126+SAH组(ERK信号通路特异性抑制剂),共4组,每组各12只。采用血管内穿刺法(PIC)法制作SAH模型,分别于造模前30min经尾静脉注射等量的生理盐水、DMSO、U0126溶液0.5mL/只,于24h处死。干湿重法测量脑组织水含量,HE染色观察海马CA1区神经细胞形态结构变化;免疫组化及Western bloting检测海马区ERK及Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平的变化。结果与Sham组比较,SAH模型组脑组织含水量明显增加,大鼠海马CA1区神经元数量明显减少(P<0.05),ERK及自噬相关因子Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达明显高于对照组(P<0.05);与SAH模型组比较,U0126组脑组织含水量明显增多,海马CA1区神经元数量明显较SAH组减少(P<0.05),ERK信号信号通路被抑制,相应自噬相关因子Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达降低(P<0.05)。结论ERK信号通路抑制剂U0126可以抑制神经细胞自噬,加重SAH的早期脑损伤。     

Apoptosis of motor neurons in the spinal cord after ischemia reperfusion injury delayed paraplegia in rabbits

Objective To clarify the pathologic change of the motor neuron on spinal cord ischemia reperfusion injury delayed paraplegia. Methods The infrarenal aorta of White New Zealand rabbits （n=24） was occluded for 26 minutes using two bulldog clamps. Rabbits were killed after 8, 24, 72, or 168 hours （n=6 per group）, respectively. The clamps was placed but never clamped in sham-operated rabbits （n=24）. The lumbar segment of the spinal cord （L5 to L7） was used for morphological studies, including hematoxylin and eosin staining, the expression of bcl-2 and bax proteins in spinal cord was detected with immunohistochemistry. The apoptotic neurons in spinal cord were measured with terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end-labeling of DNA fragments （TUNEL） staining. Results Delayed paraplegia occurred in all rabbits of ischemia reperfusion group at 16-24 hours, but not in sham groups. Motor neurons were selectively lost at 7 days after transient ischemia. After ischemia, the positive expression of bcl-2 protein were in the sham controls but decreased significantly as compared with that of the IR group （P〈0.01）, especially in 72 hours reperfusion. The positive expression of bax protein were also in the sham controls, but increased in the IR group, especially in 72 hours reperfusion; In addition, TUNEL study demonstrated that no cells were positively labeled until 24 hours after ischemia, but nuclei of some motor neurons were positively labeled at peak after ischemia reperfusion at 72 hours. Oenclusion Spinal cord ischemia in rabbits induces morphological and biochemical changes suggestive of apoptosis. These data raise the possibility that apoptosis contributes to neuronal cell death after spinal cord ischemia reperfnsion.     

益气活血开窍复方对缺血再灌注脑组织兴奋性氨基酸及超微结构的影响

目的　探讨益气活血开窍复方对缺血再灌注脑组织保护作用的机理。方法　以线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型 ,采用全自动氨基酸分析仪、干湿重法、原子吸收分光光度计测量脑组织中兴奋性氨基酸 (EAA)含量、含水量及钙离子 (Ca2 + )含量 ,电子显微镜观察脑组织超微结构改变。结果　中药组谷氨酸 (Glu)含量下降 (P <0 .0 1) ,谷氨酸 /γ 氨基丁酸 (Glu/GABA)趋向于正常比值 ,脑组织含水量及Ca2 + 浓度下降 (P <0 .0 5 )。中药可减轻由于缺血再灌注所导致的细胞超微结构的改变。结论　益气活血开窍方通过抑制EAA释放、Ca2 + 内流而发挥脑组织保护作用。     

Na~+通道阻断剂对脑缺血海马锥体细胞损伤的保护作用

实验为观察在脑一过性缺血条件下,Ｎａ＋ 通道阻断剂对海马ＣＡ１ 区锥体细胞是否具有保护作用,对９ 月龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠进行实验。通过脑室内单独注射利多卡因、利多卡因和呋喃苯胺酸复合应用,用Ｈ Ｅ染色方法通过计算机对海马ＣＡ１ 区神经元计数。结果发现,单独注射２％ 利多卡因５μｌ,对海马ＣＡ１ 区锥体细胞无保护作用;２％ 利多卡因和２％ 呋喃苯胺酸各２５μｌ联合应用,与对照组相比,具有显著性差异（ Ｐ＜ ０．０１）。实验结果提示,Ｎａ＋ 通道阻断剂联合应用,可能是预防脑缺血引起海马ＣＡ１ 区神经细胞损伤的重要途径之一     

黄芪预处理对家兔心肌缺血再灌注后心肌线粒体结构及功能的影响

目的 观察黄芪预处理对兔心肌缺血再灌注时心肌线粒体功能及结构的影响.方法 将家兔32只随机分为假手术组(A组)、心肌缺血再灌注组(B组)、黄芪预处理组(C组)和5-羟葵酸加黄芪预处理组(D组),每组8只动物.观察线粒体Ca2 浓度、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及线粒体超微结构的改变.结果 黄芪预处理组SOD活性明显高于心肌缺血再灌注组(P<0.05),而Ca2 浓度、MDA含量则低于心肌缺血再灌注组(P<0.05,P<0.01).5-羟葵酸加黄芪预处理组与心肌缺血再灌注组各指标比较,差异无统计学意义.黄芪预处理组同心肌缺血再灌注组和5-羟葵酸加黄芪预处理组相比较,线粒体超微结构损伤明显减轻.结论 黄芪可降低线粒体氧自由基水平、减轻线粒体钙超载,从而改善缺血再灌注心肌的线粒体结构及功能,发挥心肌保护作用,且其很可能通过线粒体ATP敏感性钾通道发挥作用.     

脑室内注射胰岛素对大鼠全脑缺血后海马CA1区Bcl-2 mRNA变化及其蛋白表达的影响

目的观察胰岛素对全脑缺血后海马CA1区Bcl-2 mRNA含量变化及其蛋白表达的影响,探讨胰岛素保护作用的机制。方法利用4-VO法制作大鼠全脑缺血模型。造成脑缺血15 min后行再灌注,治疗组于再灌注后即刻经脑室注入1 u胰岛素(10μL,1×105u/L),缺血组则经脑室注入10μL生理盐水。利用反转录PCR(RT-PCR)、免疫组化及Western-blot法分别于全脑缺血后1、3、5 d观察海马CA1区Bcl-2蛋白表达及其mRNA相对含量的变化。结果全脑缺血后1、3、5 d治疗组海马CA1区可见呈阳性表达的Bcl-2蛋白,而缺血组海马CA1区Bcl-2蛋白的表达则呈阴性;Western-blot分析,全脑缺血后1、35、d治疗组海马CA1区Bcl-2蛋白电泳条带密度分别为2 890.791±213.616,3 147.396±243.561和2 594.834±204.736,明显高于缺血组的743.376±84.123,804.637±64.547和637.867±54.394(P<0.01)。全脑缺血后1、35、d缺血组及胰岛素治疗组海马CA1区Bcl-2 mRNA相对含量则未见明显差异。结论全脑缺血后脑室内注入胰岛素可能通过促进海马CA1区神经元Bcl-2基因的翻译途径从而促进Bcl-2蛋白表达,这可能是其对全脑缺血后海马CA1区神经元产生中枢直接保护作用的主要机制之一。     

高氧液对家兔急性脑缺血损伤的治疗作用

目的　探索高氧液对兔急性全脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法　钳闭双侧颈总动脉并降压建立家兔全脑缺血模型,18只模型随机分3组:对照组(CG) 用平衡盐液再灌注,治疗组(TG) 用高氧液再灌注,均 20 mL/kg静注;预处理组(PG)实验前3 d,高氧液 20 mL/kg静注,每天 1 次。每组在缺血前、缺血 20 min和再灌注 45 min各抽取颈内动脉血测定动脉氧分压(PaO2)和丙二醛(MDA)含量。72 h后处死动物,行海马 CA1 区组织病理学观察。结果　再灌注后TG组和PG组MDA含量与海马神经元坏死数量明显低于CG组,PaO2明显高于CG组。结论　高氧液对急性脑缺血有一定保护作用。     

肿瘤坏死因子α、白介素1β和舒马曲坦对大鼠三叉神经节离体培养后降钙素基因相关肽mRNA表达水平的影响

目的探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和抗偏头痛药物舒马曲坦(Sumatriptan)对大鼠三叉神经节(TG)离体培养后降钙素基因相关肽(CGRP)mRNA表达水平的影响及其细胞内信号转导机制。方法将不同浓度的TNF-α、IL-1β、IL-2和Sumatriptan分别加入DMEM培养液中,与SD大鼠TG离体孵育24h;进一步将细胞内丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导系统ERK1/2、JNK、P38三条信号通路关键激酶特异性阻断剂PD98059、SP600125、SB239063加入DMEM培养液中,30min后分别加入有效浓度的炎性因子TNF-α和IL-1β后,与大鼠TG共同孵育24h,实时定量PCR(RT-PCR)法检测TG内CGRP-mRNA表达水平变化。结果 50μg/L的TNF-α、25μg/L的IL-1β可明显上调离体TG内CGRP-mRNA表达水平(P<0.05),0.1g/L和0.5g/L Sumatriptan能显著下调TG内CGRP-mRNA表达水平,而20～80μg/L的IL-2对CGRP-mRNA表达无影响。特异性阻滞剂SP600125、SB239063分别与50μg/L TNF-α、25μg/L IL-1β孵育24h后,CGRP-mRNA表达量较对照组显著降低(P<0.05)。结论 TG离体培养时,炎性因子TNF-α、IL-1β可显著上调CGRP-mRNA表达水平;一定浓度的舒马曲坦能下调CGRP-mRNA表达;JNK和P38信号转导通路参与了TNF-α、IL-1β诱导的TG内CGRP-mRNA上调过程。     

芪丹通脉片对急性缺血再灌注大鼠心肌信号转导系统PI3K/Akt和Erk1/2的影响

目的观察中药芪丹通脉片对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡和细胞信号转导系统中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、丝(苏)氨酸激酶(Akt)和细胞外信号调节激酶(Erk1/2)的影响。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(模型组)和芪丹通脉片预处理组。生理盐水或芪丹通脉片灌胃7 d后,大鼠麻醉开胸,结扎冠状动脉前降支40 min,再灌注4 h。伊文氏兰和TTC染色测定心肌梗死范围,计算梗死面积(IS)与缺血区面积(AAR)的比值(%,IS/AAR);TUNEL方法定性和定量检测心肌细胞凋亡指数;Westernblot测定信号蛋白的表达。结果芪丹通脉片组的心肌梗死范围明显小于模型组[(28.8±8.4)%vs.(49.1±10.3)%,P<0.01];其心肌细胞凋亡指数亦显著低于模型组[(11.6±2.3)%vs.(20.3±4.5)%,P<0.01];而其Akt和Erk1/2的磷酸化表达水平增加,与模型组比较分别增加了2.5倍和1.9倍(P<0.01,P<0.05)。结论芪丹通脉片能够抑制缺血再灌注所致的心肌细胞损伤,并影响生存信号通路PI3K/Akt和Erk1/2的活化水平。