人骨髓间充质干细胞生物学特性及腺病毒介导的GFP标记

目的建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分离、培养以及鉴定的方法,同时应用腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)检测细胞转染的效率。方法应用人淋巴细胞分离液(Ficoll)对hMSCs进行分离,经贴壁纯化后用MTT法检测增殖能力;并对其成骨、成脂、成平滑肌诱导分别进行碱性磷酸酶(ALP)、油红O染色及α-SMA免疫细胞化学检测;采用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面标志的表达。用Ad-GFP转染,并应用荧光显微镜与FCM检测转染效率。结果 hMSCs镜下为成纤维样形态,约在第4天进入对数增长期;分化诱导后ALP染色、Von kossa银染、油红O染色以及α-SMA均为阳性;FCM检测CD14、CD31、CD45表达阴性,CD44、CD73、CD106及PDGFRβ表达阳性;当感染复数MOI=200,细胞培养48h时感染效率较高,FCM检测显示为99.81%。结论经过对增殖、分化能力以及表面标志的分析,证明用Ficoll可以分离得到较纯的hMSCs,Ad-GFP可以很好地感染细胞,为组织工程种子细胞的体内示踪提供了途径。     

超声及超声微泡介导基因转染的可行性研究

目的探讨超声、超声造影剂微泡介导基因转染的可行性及所需超声照射时间。方法选择超声能量在MI=1.5、超声频率f=8MHz,向人脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液加入微泡后分别超声辐照20s、1、5、10、15、30min,继续培养24h。然后用台盼蓝拒染法计数活细胞,各组与对照组(无辐照)行统计学分析,选择超声辐照的最佳时长。然后,微泡与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒充分孵育后,采用该时长进行超声微泡介导基因转染试验,细胞继续培养48h后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达。结果超声辐照10、15、30min组细胞计数比对照组降低,差异有统计学差异(P<0.05)。利用超声能量在MI=1.5、超声频率f=8MHz条件下辐照5min,继续培养48h后荧光显微镜观察,有EGFP表达,细胞生长良好。结论超声微泡能够促进质粒进入细胞并转染基因。超声能量MI=1.5、超声频率f=8MHz时,超声微泡介导基因转染的最佳辐照时长为5min。     

一种改良式质粒DNA提取方法的建立与应用

目的建立一种稳定、可靠的质粒DNA提取改良方法,探讨其在分子生物学实验研究中的应用价值。方法将含有目的质粒的菌株扩增后,运用改良后的碱裂解法进行质粒DNA小量提取,微量核酸仪测定提取质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、内切酶酶切及质粒转染真核细胞鉴定提取质粒DNA的质量及转染效率。结果改良式质粒提取方法获得质粒DNA产量为3.2 mg/L菌液,A260/280=1.91;内切酶酶切完全;质粒DNA以超螺旋结构为主;真核细胞转染效率为20%左右。结论改良式质粒DNA抽提方法操作简单、实用,获得质粒DNA产量多、质量高,能达到分子生物学常规实验的要求。     

核转录因子激活蛋白-1对PPARδ表达的调控作用

目的研究在过氧化物酶体增长因子活化受体δ(PPARδ)表达中的相关调控因子。方法用RT-PCR扩增人类PPARδ启动子序列,通过Deletion及重组将不同长短的PPARδ启动子序列转化到PGL3-basic载体中,转染LOVO细胞,通过观测各重组体转染活性,确定PPARδ启动子活性区域。再通过电泳迁移率变更分析(EMSA)、突变等方法确定核转录因子激活蛋白-1(AP1)对PPARδ表达的作用。结果Deletion及重组转染后发现PPARδ启动子活性区域在序列3361~3464之间,EMSA、突变发现AP1因子结合位点突变后转染活性明显降低。结论AP1因子结合位点突变后转染活性明显降低,提示AP1是PPARδ的一个增强子。     

短发卡RNA抑制survivin表达并诱导CNE-2细胞凋亡

目的观察以短发卡RNA(shRNA)抑制鼻咽癌细胞survivin表达对细胞凋亡与增殖的影响。方法构建特异性survivin shRNA,转染CNE-2细胞。分组:A组为空白对照组;B组为阴性干扰组,转染pSIREN-survivin/nonsenseshRNA;C组为阳性干扰24h组,转染pSIREN-survivin/shRNA;D组为阳性干扰48h组,转染pSIREN-survivin/shRNA。以RT-PCR、Western-blot分别测定细胞survivin mRNA及蛋白,PI、TUNEL及MTT检测细胞周期、凋亡率、细胞增殖。结果转染效率约(70.90±4.76)%;C组survivin mRNA和蛋白抑制率分别为(41.58±0.63)%、(68.29±0.52)%;D组抑制率分别为(63.64±0.96)%、(70.83±0.48)%。C组凋亡率为(36.24±0.78)%,D组为(50.37±0.85)%,显著高于B组和A组;S期细胞减少,G2/M期比例增高;MTT结果提示细胞增殖受到明显抑制。结论特异性shRNA可有效干扰CNE-2内survivin的表达,诱导细胞凋亡并抑制其过度增殖。     

siRNA抑制hTERT对脑胶质瘤T98G细胞增殖及周期的影响

目的研究人端粒酶逆转录酶被抑制后胶质瘤细胞系体外增殖及周期的变化,以期寻找控制胶质瘤细胞恶性行为的有效途径。方法人工合成小干扰RNA(siRNA)序列,并将其通过lip2000转入体外培养的T98G胶质瘤细胞系中,荧光显微镜观察转染效率,免疫印记检测蛋白表达情况,MTT法检测细胞体外增殖表现,绘制生长曲线图,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果成功转染siRNA,并有效抑制人端粒酶逆转录酶的活性,免疫印记验证干扰效果可靠,体外可抑制胶质瘤细胞的增殖,与对照组比较其抑制效率的差异有统计学意义(P<0.05)。结论体外条件下,可以通过siRNA有效抑制人端粒酶逆转录酶,从而有效抑制胶质瘤细胞的体外增殖,使胶质瘤细胞周期发生变化。这可能为胶质瘤的治疗带来新的启示。     

血管抑素对胰腺癌血管生成的抑制作用

目的观察血管抑素在胰腺癌血管生成中的作用。方法采用Lipofectamine 2000基因转染技术将真核表达载体pcDNA3.1(+)-angiostatin导入人胰腺癌PC-3细胞,筛选阳性克隆并扩大培养。PC-3细胞分为血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组,分别检测各组血管抑素蛋白表达;利用显微镜下细胞计数法测定转染前后PC-3细胞的体外生长曲线;检测各组PC-3细胞培养上清所分泌的血管抑素对血管内皮细胞ECV-304增殖的影响。进一步建立种植瘤模型,通过CD34染色法检测Angiostatin对种植瘤中血管密度的影响。结果 Western blotting检测显示血管抑素转染组的PC-3细胞可分泌血管抑素,而空白对照组及脂质体对照组的PC-3细胞无血管抑素的分泌;细胞生长曲线显示,血管抑素转染组、空白对照组及脂质体对照组的细胞生长速度和倍增时间无明显差异;3组PC-3细胞上清液对内皮细胞ECV-304的生长有明显差异,血管抑素转染组的生长明显低于空白对照组及脂质体对照组。体内试验显示血管抑素转染组的种植瘤生长明显低于空白对照组及脂质体对照组。血管抑素转染组的种植瘤微血管密度(19.6±3.6)显著少于空白对照组(48.5±4.7)和脂质体对照组(51.1±5.4)。结论血管抑素可抑制血管内皮细胞的增殖,进一步产生抑制胰腺癌血管生成效应。     

原癌基因Fra-1高表达与乳腺癌细胞转移表型的关系

目的研究原癌基因Fra-1与人乳腺癌细胞系MCF-7细胞侵袭及迁移的关系。方法提取乳腺癌细胞系MDA231细胞的总RNA,通过RT-PCR扩增Fra-1全长基因,将其克隆入pcDNA3.1(-)myc-his表达载体;应用脂质体法转染MCF-7细胞,观察Fra-1过表达对MCF-7细胞增殖、黏附和迁移的影响。结果高表达Fra-1增强了MCF-7细胞的增殖、黏附和迁移的能力。结论原癌基因Fra-1可能通过促进肿瘤细胞的增殖、黏附和迁移,在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率。方法应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs,贴壁法不断纯化,流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达,然后用pEGFP-N3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率。结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形,有聚集生长的倾向,多3~5个细胞成为一个集落。传代后,细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样,长梭形,胞浆突起较少,胞体轮廓不甚清晰,胞体也相对较大;②GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达最强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达;③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关,1∶2到1∶3最高。结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;GFP转染是一种较好的MSCs标记方法。     

重组小鼠血管抑素基因在胆囊癌细胞中的表达及对血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的　研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞能否表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白。方法　应用脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC SD ,G4 18抗性筛选 ;以Westernblot检测血管抑素的表达 ,以血管内皮细胞增殖分析检测其活性。结果　经Westernblot检测 ,得到高表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆 ,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖 (P <0 .0 5 )。结论　小鼠血管抑素基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转导的胆囊癌细胞能够表达具有生物学活性的血管抑素蛋白 ,在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值