碘对神经细胞生长分化蛋白NSE、NGF和IGFR表达的影响

目的　研究碘对体外神经细胞生长发育的直接影响及可能的作用机制。方法　采用体外新生大鼠皮层神经细胞培养法观察微量元素碘对神经细胞表达NSE、NGF和IGFR蛋白的影响。结果　①高浓度碘能增加体外培养的神经细胞表达NSE蛋白 ;②碘在培养的 5、6、7d时NGF蛋白的表达较对照组明显增强 ;③中、高浓度的碘能显著增强体外培养的大鼠皮层神经细胞IGFR蛋白的表达。结论　碘可能是通过促进、增强NSE、NGF和IGFR蛋白的表达 ,进而直接作用于体外培养的神经细胞 ,促进神经细胞的生长、发育与分化     

低硒大鼠心肌线粒体CytC含量的动态变化及其在心肌细胞凋亡中的作用

目的检测低硒大鼠心肌线粒体中细胞色素C(CytC)的蛋白含量及心肌细胞凋亡情况,探讨低硒时CytC在线粒体介导的细胞凋亡中的作用机制。方法构建低硒大鼠模型,于喂养20、30、40周时提取心肌线粒体,Western Blot法检测线粒体中CytC的蛋白表达;免疫组织化学技术(SP法)对死亡结构域蛋白FADD进行原位染色,统计阳性细胞指数,并对CytC与心肌细胞凋亡指数进行相关性分析。结果低硒组CytC的表达与相应时段的对照组相比均降低,且随低硒喂养时间延长,降低更为明显,差异均有统计学意义(P<0.05);各时间对照组间心肌线粒体中CytC的表达无明显差异;免疫组化染色显示,随着喂养时间的延长,低硒组大鼠心肌细胞凋亡加重;相关性分析显示,线粒体内CytC表达与心肌细胞凋亡指数呈负相关(rs=-0.858,P<0.01)。结论低硒可影响大鼠心肌线粒体中CytC蛋白的表达;CytC表达与心肌细胞凋亡指数具有相关性,提示CytC在线粒体介导的心肌细胞凋亡中起重要作用。     

运动对急性癫痫大鼠海马神经发生的影响

目的探讨中等负荷运动对急性癫痫大鼠海马神经发生的影响。方法应用免疫荧光单标记和激光共聚焦显微镜观察癫痫大鼠在中等负荷运动后海马齿状回新生神经元的5-溴脱氧尿核苷(BrdU)表达情况;应用RT-PCR半定量分析癫痫大鼠在中等负荷运动后海马神经生长因子(neurotrophic growth factor,NGF)的表达情况。结果运动组癫痫大鼠海马齿状回BrdU的表达比未运动组癫痫大鼠表达减少,差异有统计学意义(P<0.01);运动组癫痫大鼠海马NGF基因表达比未运动组癫痫大鼠也下调,差异有统计学意义(P<0.01),且海马NGF基因表达与齿状回BrdU的表达变化相一致。结论中等负荷的运动可减少急性癫痫大鼠海马新生神经元BrdU的表达,而NGF对急性癫痫大鼠神经发生可能有一定的促进作用。     

人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性。方法　将 NGFβ目的基因亚克隆入表达载体pBV220的BamHI- BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达产物复性,将复性后的蛋白质加入体外培养的鸡胚背根神经节及 PC12 细胞BrdU掺入实验,观察表达蛋白的生物学活性。结果　成功构建了重组质粒 pBV220/NGFβ。使用该质粒转化 DH5α宿主菌,使用热诱导方法表达了NGFβ蛋白,SDS PAGE结果提示表达蛋白主要存在于包涵体中。通过肝素亲和层析可以获得纯度大于90%的 NGFβ。每升表达菌可以获得 1.8~2.0 mg NGFβ。鸡胚背根神经节突起生长实验和PC12细胞培养生长刺激BrdU掺入实验表明原核表达的 NGFβ是具有生物活性的。它的生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×105 BU/g。结论　在大肠杆菌中可以表达出有活性的NGFβ蛋白。     

小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法

目的建立一种操作简便、高纯度的小鼠背根神经节神经细胞原代培养的方案。方法取6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠的背根神经节,使用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化,获取背根神经节神经细胞,采用小鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定并测定细胞纯度。结果培养的原代神经细胞生长良好,纯度可达90%,用含有神经生长因子(NGF)的DMEM培养基培养,存活时间可达60 d。结论该方案简单稳定,可培养出大量高纯度的神经细胞,为深入研究神经细胞提供了可靠的模型。     

人参皂苷Rg1对大鼠脊髓缺血再灌注损伤中survivin蛋白表达及细胞凋亡的影响

目的观察人参皂苷Rg1预处理对于大鼠脊髓缺血再灌注损伤后的survivin蛋白表达及细胞凋亡的影响,探讨人参皂苷Rg1对脊髓缺血再灌注损伤后大鼠运动功能恢复的可能机制。方法选取成年健康的SD大鼠120只,构建大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型,随机分为假手术组、缺血组、缺血再灌注组及药物组。采用后肢神经运动功能(BBB)评价大鼠后肢神经运动功能;免疫组化法观察survivin蛋白及凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)表达;Western blot及RT-PCR方法分析各组survivin及Caspase-9的表达和活性。结果人参皂苷Rg1的干预可以使大鼠后肢神经运动功能评分升高,AIF阳性细胞数减少、survivin蛋白阳性细胞数增多、survivin及Caspase-9的表达减少、神经细胞凋亡减少。结论人参皂苷Rg1可能通过促进survivin蛋白的表达来抑制Caspase-9表达以及降低胞质AIF的水平介导大鼠脊髓缺血再灌注损伤造成的细胞凋亡。     

哮喘大鼠肺内神经生长因子的表达变化及与病理改变的关系

目的探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)致哮喘大鼠肺内病理改变及被拮抗后肺内表达的变化,为哮喘的发病机制和治疗提供理论依据。方法随机将48只SD大鼠分为:正常对照组、哮喘组和抗NGF干预组,每组均16只。取肺组织在光镜下测量支气管基底膜厚度并计数黏膜下成纤维细胞的数目,HE染色观察气道病理改变并测量呼吸道平滑肌厚度;用免疫组化法检测肺组织NGF的表达。结果哮喘组肺组织NGF表达较对照组明显增强(P<0.01);NGF的表达与呼吸道平滑肌厚度有明显相关性;哮喘组呼吸道平滑肌厚度、网状基底膜厚度、黏膜下成纤维细胞数目及NGF的表达均高于对照组和抗NGF干预组(P<0.05);抗NGF干预组显著缓解上述变化(P<0.05)。结论支气管哮喘大鼠气道组织中NGF表达显著增加,并与呼吸道平滑肌厚度等有关,同时与支气管哮喘的气道炎症有明显相关,予抗NGF干预后可以抑制气道炎症。     

苦参碱对体外培养的人ACHN肾癌细胞的生长抑制作用及其机制

目的 观察苦参碱对体外培养的人ACHN肾癌细胞的生长抑制作用,并探讨其可能的作用机制.方法 应用不同浓度的苦参碱分别作用于人肾癌ACHN细胞株24、48、72、96h,采用MTT 法观察苦参碱对ACHN的细胞毒作用;透射电镜和流式细胞术检测苦参碱对ACHN细胞凋亡的影响;免疫细胞化学技术检测苦参碱对ACHN细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.结果 不同浓度的苦参碱对ACHN细胞株均有一定的增殖抑制作用,且呈量效和时效关系;苦参碱能明显诱导ACHN细胞株凋亡;苦参碱作用后,ACHN细胞株Bax蛋白表达明显增强,Bcl-2蛋白表达有下降趋势,但无统计学差异.结论 苦参碱对体外培养的人肾癌ACHN细胞株有显著的增殖抑制作用,其机制可能与调节Bcl-2/Bax蛋白表达比值、诱导细胞凋亡有关.     

芹菜素通过抑制NF-κB信号通路缓解高糖对雪旺细胞的损伤

目的研究芹菜素对高糖培养条件下雪旺细胞损伤的保护作用,为芹菜素治疗糖尿病周围神经损伤提供初步的实验依据。方法体外培养RSC96雪旺细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.6 mmol/L)、高糖组(培养液葡萄糖浓度为50 mmol/L)和芹菜素组(在高糖基础上加入0.1、1.0、10.0μmol/L芹菜素)。CCK-8法检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测神经生长因子(NGF)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达;Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、NF-κB、p-NF-κB的表达。qRT-PCR检测细胞中Bcl-2和Bax的mRNA表达。结果与高糖组比较,低浓度的芹菜素(≤1.0μmol/L)提高细胞活性(P<0.05),并存在浓度依赖性;10.0μmol/L芹菜素对细胞增殖则没有明显作用。1.0μmol/L芹菜素显著抑制高糖培养条件下细胞凋亡(P<0.05)。同时,芹菜素显著增加高糖培养条件下细胞中Bcl-2蛋白和mRNA表达,但抑制Bax基因蛋白和mRNA表达。与高糖组比较,1.0μmol/L芹菜素显著增加NGF表达,并抑制TNF-α表达(P<0.05)。此外,芹菜素可显著抑制高糖培养条件下NF-κB磷酸化水平(P<0.05)。结论芹菜素增加高糖诱导的雪旺细胞活性,抑制细胞凋亡并调节NGF和TNF-α表达,该机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

葛根素降低细胞内Ca2+浓度并上调BDNF保护血管性痴呆大鼠海马神经细胞

目的 观察葛根素对血管性痴呆(VD)大鼠海马神经细胞内Ca²⁺浓度及脑源性神经生长因子(BDNF)的影响,探讨葛根素保护神经细胞的可能机制。方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和葛根素干预组,采用间隔3 d结扎双侧颈总动脉法建立VD模型;术后2周用Morris水迷宫评估大鼠学习记忆能力,免疫组化和Western blotting检测大鼠海马组织BDNF的表达情况,流式细胞仪检测平均荧光强度来表示细胞内游离Ca²⁺浓度。结果 葛根素干预组Morris水迷宫逃避潜伏期显著缩短,海马BDNF表达量显著增加,海马神经细胞内Ca²⁺浓度减低;与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 葛根素对VD大鼠具有神经保护作用,其作用机制可能与葛根素降低海马神经细胞内Ca²⁺浓度及上调BDNF的表达有关。     

PROPERTIES OF PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF NEONATAL RAT RETINAL PROGENITOR CELLS IN VITRO

Objective To investigate the properties of proliferation and differentiation of neonatal rat retinal progenitor cells （RPCs） in vitro. Methods RPCs were isolated from neonatal SD rats neural retina and cultured in DMEM/F12 ＋ N2 with EGF and bFGF （suspension medium ） or 10 % FBS without EGF and bFGF （ differentiation medium）. The cells grew as suspended spheres or adherent monolayers, depending on different culture conditions. The neural stem cells or retinal progenitors, neurons, astrocytes, retinal ganglion cells, rod photoreceptors and the proliferating cells were evaluated with immunofluorescence analysis by Nestin or Pax6, Map2, GFAP, Thy-1, Rhodopsin and BrdU antibodies respectively. Results RPCs could propagate and differentiate in suspension or differentiation medium and express the markers of Nestin （92.86%） or Pax6 （86.75%）, Map2 （38.54%）, GFAP （20.93%）, Thy-1 （27. 66%） and Rhodopsin（13. 33%）in suspension medium; however, Nestin （60.27%）, Pax6 （52%）, Map2 （34.94%）, GFAP （38.17%）, Thy-1 （30.84%） and Rhodopsin （34.67%） in differentiation medium. 96.4 % of the population in the neurospheres was BrdU-positive cells. The cells could spontaneously adherent forming some subspheres and retinal specific cell types. Conclusion Neonatal rat RPCs possess the high degree of proliferation and can differentiate into neurons, astrocytes, retinal ganglion cells and rod photoreceptors in vitro. There are different proportions for RPCs to differentiate into specific cell types.     

新生鼠实验性缺氧缺血性脑损伤时大脑皮质NSE和GFAP的变化

目的　了解新生鼠缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)时大脑皮质神经元特异性烯醇化酶 (NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的变化。方法　 7日龄SD鼠经右侧颈总动脉结扎加缺氧处理建立HIBD动物模型。用免疫组织化学法检测对照组和HIBD组新生鼠大脑皮质NSE、GFAP的含量。结果　①HIBD后 2 4h损伤部位大脑皮质NSE含量显著降低 ,7d后有所升高但仍低于正常对照组。②正常情况下GFAP在新生鼠大脑皮质中的表达局限而稀少 ,HIBD后 2 4h损伤部位大脑皮质的GFAP表达无明显变化 ,HIBD后 7dGFAP表达明显增加 ,广泛分布于损伤部位的大脑皮质中。结论　①新生鼠HIBD早期大脑皮质NSE含量即明显降低 ,提示NSE可作为判断神经元损伤的特异性指标之一 ;②新生鼠HIBD恢复期 ,脑损伤部位的GFAP明显增加 ,提示其可能参与了损伤区的修复。     

THE EFFECT ON PROTEOGLYCAN METABOLISM OF DEOXYNIVALENOL AND SELENIUM IN THE CULTURED HUMAN FETAL CHONDROCYTES IN VITRO

Kashin BeckDisease(KBD)isasevere,en demicosteoarthrosis,butitspathogenesisisstilla pendentproblem.Withregardtoetiologyanalysis,mycotoxinhypothesisandlow seleniumhypothesis havebeenstudiedmoreinChina[1].Thepathologi calfeaturesofKBDarethedegenerationandnec…     

EFFECT OF LOW SELENIUM ON CHONDROCYTE DIFFERENTIATION AND DIFFERENTIAL EXPRESSION OF COLLAGEN TYPES Ⅰ , Ⅱ AND X IN ARTICULAR CARTILAGE FROM MINI-PIGS

Objective According to the distribution of low selenium areas, low nutrition state of the residents and the affecting cartilage growth and articular cartilage of Kashin-Beck Disease(KBD),the chondrocyte differentia- tion and differential expression of collagen types Ⅰ , Ⅱ and Ⅹ in articular cartilage from Chinese mini-pigs treated with low selenium were investigated in order to gain insight into the effects of these conditions on chondrocyte differ- entiation in KBD cartilage. Mothods Eleven male juvenile mini-pigs, aged from 4 weeks to 6 weeks after birth, were divided into 3 groups. The Se content in the diet of the “low Se” group was 0. 035mg/kg diet, and 0. 175 mg/kg diet in the control. For Se-supplemented group 0. 390mg /kg diet was added. The content of Se in blood was assayed at the beginning and at the end of each experiment. Samples of articular cartilage were taken from the right femur condylus, and collagen types Ⅰ , Ⅱ and Ⅹ in articular cartilage were analyzed by immunohistochemistry and in situ hybridization. Results ①All cartilage samples from juvenile mini-pigs fed with low selenium diet revealed a re- duction in type Ⅹ collagen mRNA expression in the hypertrophic chondrocytes as shown by in situ hybridization, and reduced type Ⅹ collagen deposition in the lower hypertrophic zone as shown by immunohistochemistry. ②Addition of selenium to the diet restored the type Ⅹ collagen to normal level. ③Type Ⅱ collagen was evenly distributed over the entire articular cartilage in all experimental and control groups. Type Ⅱ collagen mRNA signals were most prominent in the upper articular layer as well as in the hypertrophic zone in all groups. Type Ⅱ collagen expression was restrict- ed to the zone of endochondral ossification in all experimental groups and the control. Conclusion Low selenium has an down-regulatory role on the synthesis and deposition of collagen type Ⅹ in hypertrophic chondrocytes in articular cartilage of mini-pigs. Supplement of the low Se diet with additional Se restored the signals of collagen type Ⅹ to nor- mal levels. These findings indicate that selenium deficiency may disturb chondrocyte differentiation to hypertrophic cells in the growth plate,and worthy to be investigated further.     

刀豆蛋白A条件化培养基对体外培养的兔角膜内皮细胞生长的影响

目的研究刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)条件化培养基对体外培养的兔角膜内皮细胞(rabbit corneal endothelial cells,RCECs)生长的影响。方法采用揭取后弹力层及内皮细胞联合组织块法进行RCECs的体外原代培养,分别用含有体积分数为5%、10%、15%、20%ConA的活化大鼠脾细胞条件上清液的RPMI1640培养基进行RCECs原代培养,并用含10%(体积分数)胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI1640培养基作为对照。神经烯醇化酶免疫组织化学染色法进行细胞鉴定;噻唑蓝比色法观察各组RCECs生长的状况;SPSS11.0One-way ANOVA及LSD检验进行统计分析。结果成功进行了RCECs的体外培养,培养细胞内神经烯醇化酶阳性表达。ConA条件化培养基各组细胞增殖均高于对照组(P<0.001),且10%、15%ConA条件化培养基组的RCECs细胞数量明显高于其他各实验组(P<0.001)。结论ConA条件化培养基具有促进RCECs生长的作用,可作为培养辅佐剂。     

雪腐镰刀菌烯醇对培养软骨细胞DNA影响及硒的保护作用

目的　探索雪腐镰刀菌烯醇 (NIV)对培养软骨细胞DNA损伤作用及硒的保护作用。方法　应用软骨细胞单层培养、碱性单细胞微量凝胶电泳、琼脂糖电泳和生化方法检测软骨细胞DNA量及损伤情况。结果　在实验设定的NIV浓度范围内 ,随NIV浓度增加DNA含量减少、DNA受损细胞增多和DNA损伤加重 ,同浓度NIV加硒组损伤情况好于未加硒组。结论　NIV对培养软骨细胞有明显损伤作用 ,加硒有保护作用。     

离体培养条件下神经生长因子对毛囊的影响

目的　观察神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)对离体培养条件下的人头皮毛囊生长的影响。方法　在离体人头皮毛囊培养模型中 ,加入 10 0 μg·L -1的NGF ,测量毛囊长度的变化以及 2 4hDNA合成率。结果　目镜测微器观测 10 0 μg·L -1的NGF与 12 5mg·L-1的米诺地尔一样能明显地促进游离的人头皮毛囊生长 (P <0 .0 5 ) ,尤以前 8d较为明显 ;3 H TdR掺入检测的DNA合成率亦明显增高。结论　 10 0 μg·L -1的NGF对游离的人头皮毛囊的生长有促进作用     

早期人胚神经干细胞分布及分离培养

目的　研究发育早期人胚脑神经干细胞的形态特征及其分布情况 ,并观察其体外生长分化特性。方法　计划生育流产的 6～ 12周胚胎大脑组织切片用vimentin抗体进行免疫组织化学染色 ,光镜观察。机械分离皮质细胞 ,用无血清培养基和含血清培养基进行悬浮和贴壁培养 ,分别用MAP2 、GFAP及GalC抗体进行免疫细胞化学染色 ,鉴定干细胞和神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结果　发育早期大脑Vimentin阳性细胞分布广泛 ,细胞形态单一 ,多呈圆球形 ,体积较小。体外培养的大脑皮质细胞在培养的第 5～ 7天时 ,形成较多克隆 ,可多次传代 ;贴壁培养时细胞发生分化 ,分别为MAP2 、GFAP、GalC阳性的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论　胚胎发育早期大脑神经干细胞分布广泛 ,形态单一 ,皮质Vimentin阳性细胞数量多 ,便于分离 ,是最佳神经干细胞分离部位 ;人NSCs可以在体外增殖并发生多向分化