Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法在获得Apoptin融合基因的基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a( )-Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a( )-Apoptin的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致。结论Apoptin原核表达载体pET-28a( )-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。     

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组载体的构建

目的设计构建携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的cDNA融合基因的重组载体,为针对Survivin的靶向治疗奠定基础。方法应用非对称引物/模板法、PCR技术制备NT4-Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片断,连接于pGEM-T-Easy载体,经克隆测序、酶切后与PBV220/NT4质粒连接;转化感受态细胞E.coliDH5α,亚克隆获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因。结果克隆出Ant-Shepherdin[79-87]基因,经酶切及测序证实结果正确;连接PBV220/NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因片断。结论通过分子生物学技术成功构建了携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。     

分泌表达NT4-AcSDKP的重组腺相关病毒对CCl_4致小鼠肝纤维化的保护

目的观察重组腺相关病毒rAAV/NT4-AcSDKP对四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化的影响。方法 30只昆明雌性小鼠随机分为正常对照组、模型组和干预组,造模采用200mL/L CCl4花生油混合液腹腔注射致小鼠肝纤维化模型,共8周,干预组小鼠在加害4周后注射重组腺相关病毒。于8周实验结束时处理存活的全部小鼠,观察重组病毒对小鼠肝组织病理变化、肝功能生化指标以及肝纤维化指标等的影响,以及NT4-AcSDKP在肝组织中的表达变化。结果融合基因在干预组肝组织中表达并且重组腺相关病毒对CCl4引起的肝组织病理有明显改善;与模型组相比,干预组小鼠的肝纤维化指标透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)的P值分别为0.00、0.00、0.01、0.03,P<0.05,差异具有统计学意义;但是谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)等肝功能生化指标的P值分别为0.89、0.38、0.58、0.32、0.32,均为P>0.05,差异无统计学意义。结论携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒对CCl4引起的小鼠肝纤维化有一定的保护作用,与近期用商品化四肽保护CCl4诱导的小鼠肝纤维化作用保持一致。     

TGFβ1-(78-109)-HBc融合蛋白的原核表达

目的　应用基因工程技术制备TGFβ1 (78- 10 9) HBc融合蛋白 ,作为TGFβ1疫苗 ,用于抗纤维化研究。方法　合成TGFβ1 (78- 10 9)编码区DNA ,连接于质粒载体 ,再在其下游连接HBc编码区 ,测序证实后 ,进行原核表达 ,表达产物以SDS PAGE、ELISA等方法鉴定。结果　经DNA序列分析证实融合基因序列完全正确 ,SDS PAGE证实原核表达产物相对分子质量为 2 5kD ,ELISA检测证实TGFβ1 (78- 10 9)和HBc的抗原表位均可正确暴露。结论　本研究成功构建了TGFβ1 (78- 10 9) HBc融合基因 ,进行了原核表达 ,并初步证实了表达产物的抗原性 ,为下一步进行TGFβ1疫苗抗纤维化的研究打下了基础     

β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备

目的　制备稳定分泌β -淀粉样肽 1～ 4 2 (Aβ1-42 )单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,产生高效价抗体。方法　通过基因工程技术 ,将Aβ1-42 基因融合于乙肝核心抗原 (HBcAg)的主要免疫优势区 (MIR) ,制备Aβ和HBcAg的融合蛋白 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0细胞融合 ,筛选能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果　得到两株能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,Aβ1-42 单克隆抗体的Ig亚类为IgG3 。结论　制备得到的Aβ1-42 单克隆抗体特异性强 ,效价高     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。     

携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建

目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒,为探讨AcSDKP(乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸)的多样化功能提供基础。方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板,PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段,插入腺相关病毒载体穿梭质粒pSSHG-CMV,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞,包装rAAV-NT4-AcSDKP,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。结果成功合成NT4-AcSDKP基因,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP,包装获得滴度为3.40×1010 copies/mL的重组腺相关病毒。结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒,为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。     

人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析

目的　克隆人脑源性神经营养因子 (hBDNF)基因并进行序列分析。方法　提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板 ,应用PCR技术和T 载体克隆法克隆hBDNF基因 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定 ,并进行序列测定和分析。结果　DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列 (M6 1 1 81 )比较 ,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp ,序列完全相同。结论　自人基因组DNA中克隆hBDNF基因 ,为进一步开展阿尔茨海默病 (AD)的基因治疗积累了资料。     

EXPRESSING HUMAN MATURED BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR GENE IN E. Coli AND DETERMINING ITS BIOACTIVITY

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)is amember of the family of neurotrophins['J. The hu-man BDNF gene is localized on chromosome of1lp13. The nucleotide sequence that is 744bpIength including signal sequence and prosequenceshows an open reading frame to encode a precursorof 247 amino acids. The matured BDNF consists ofll9 amino acids (relative molecular mass of 14Kd,PI~l0)['.'j. The activity of BDNF in the nervoussystem is widespread. BDNF could support the sur-vival of cranial …