耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的判定标准研究

目的建立耳蜗外毛细胞(OHCs)静纤毛束变异的形态学统一判定标准。方法光镜和扫描电镜观察豚鼠耳蜗OHCs静纤毛束变异形态学特征及听觉诱发电位(ABR)、听神经动作电位(CAPs)和耳声发射畸变产物(DPOAE)参数改变。结果在100只实验豚鼠中,有28%的动物OHCs静纤毛束变异;OHC1变异最多见转位90°,常可见连续数个毛细胞90°转向蜗底,部分毛细胞静纤毛束“W”型转位达180°。结论我们拟定耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的标准为:①超过10%的耳蜗第一排外毛细胞静纤毛束的“W”型变形及转向,毛细胞由45°转位至90°改变,多向基底方向,且呈双侧性。②毛细胞静纤毛束变异程度分为Ⅰ型:50%的OHC变异为重度变异;Ⅱ型:30%的OHCs变异为中度变异;Ⅲ型:10%以上的OHCs变异为轻度变异;③耳蜗毛细胞静纤毛束变异动物的双侧耳听功能(ABR、CAP、DPOAE)改变。     

耳蜗用微量渗透泵灌注生长因子对庆大霉素致聋豚鼠的治疗作用

目的　应用微量渗透泵 (Mini- Osmotic pump,MOP)给正常动物耳蜗和庆大霉素 (GM) )致聋豚鼠耳蜗长期恒速灌注人工外淋巴和表皮生长因子 (Epidermal growth factor,EGF) ,观察其对听力和内耳组织形态的影响。方法　用 Alzet model- 2 0 0 4型 MOP向三组各 1 0只的正常豚鼠 A组和 GM致聋豚鼠 B组 ,耳蜗底回鼓阶灌注人工外淋巴液 ,同法给 GM致聋豚鼠耳蜗灌注EGF设为 C组 ,在 MOP埋植前和埋植后 1、2、3和 4周测定 ABR反应阈值 ,用扫描电镜观察各组动物耳蜗 Corti器的组织形态改变。结果　 MOP给正常动物灌注人工外淋巴对 ABR和耳蜗内外毛细胞无明显影响 ,而给 GM致聋组豚鼠耳蜗灌注 EGF可促进受损内耳组织细胞修复 ,使ABR阈值改善。结论　应用 MOP可向耳蜗长期恒速灌注人工外淋巴 ,对耳蜗功能和形态无明显影响 ;而长期恒速灌注 EGF对 GM耳中毒豚鼠的耳蜗毛细胞有修复治疗作用。可使 ABR反应阈值下降     

庆大霉素损害鸡耳蜗后毛细胞再生的超微结构及其与听功能恢复的关系

给实验组鸡按50mg／（kg·d）剂量肌注庆大霉素共10d后，间隔1、3、6、9和12d对实验组和对照组鸡耳蜗电位（Ap）及听觉脑干诱发电位（ABR）进行测定，随后处死动物，用透射电镜（TEM）和扫描电镜观察鸡基底乳头（BP）毛细胞再生的超微结构和过程，结果可见毛细胞再生来源于Bp表层扁平状或立方形上皮细胞，在早期再生毛细胞胞质密度高，含有大量的线粒体，随后静纤毛长出，细胞核出现，表皮极发育成熟时静纤毛束形成，其毛细胞底部的神经末梢已长出，此时伴有Ap和ABR阈值的恢复。说明再生毛细胞形态成熟时已具有听觉功能的恢复，再生毛细胞在受损耳蜗听功能的恢复过程中起主要作用。     

豚鼠化脓性中耳炎耳蜗柯蒂氏器扫描电镜观察

本实验以鼓泡接种金黄色葡萄球菌的方法诱发豚鼠的化胀性中耳炎,用扫描电镜观察接种细菌后1、2、4及6周不同时间豚鼠柯蒂氏器的病理改变,发现受试动物的耳蜗各回均可见不同程度的毛细胞静纤毛异常、细胞缺失及支持细胞的损伤等。另外,本实验还显示了外毛细胞消失及支持细胞指状突修复前后的一些表现。     

顺铂对小鼠耳蜗毒性及caspase-3表达的影响

目的 建立小鼠顺铂耳毒性模型,研究不同剂量顺铂对小鼠耳蜗毒性及caspase-3表达的影响.方法 69只昆明小鼠随机分成对照组、顺铂2.5mg/(kg·d)组、顺铂3.5mg/(kg·d)组和顺铂4.5mg/(kg·d)组,腹腔连续注射5d.通过听脑干反应(auditory brainstem response, ABR)测试观察用药前后小鼠听力的变化;应用免疫组织化学Envision法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)在耳蜗中的表达.结果 不同剂量顺铂组小鼠体重和听力明显下降,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05,P<0.01);并且随着顺铂给药剂量的增加,小鼠耳蜗中caspase-3表达亦明显增强.结论 应用顺铂可建立小鼠耳毒性模型;caspase-3参与了顺铂致小鼠耳蜗细胞损伤的过程,提示内耳细胞凋亡可能是顺铂的耳毒性机制之一.     

腺病毒携带GFP在豚鼠耳蜗基因转导的形态结构与功能改变

目的　带有绿色荧光蛋白 (GFP)基因的腺病毒注入豚鼠耳蜗后 ,观察不同时间段GFP基因的表达和分布情况及手术操作对听力的影响 ,为内耳基因治疗提供理论依据。方法　 1 5只杂色豚鼠术前及术后行听性脑干反应 (ABR)和畸变耳声发射 (DPOAE)检查 ,空白对照组经圆窗或底回钻孔注入人工外淋巴液。实验组注入带有GFP基因的腺病毒。分别于 3、5、7和 1 0d后取材 ,耳蜗标本经硝酸银染色后铺片。结果　腺病毒注入耳蜗后对听阈影响不大。术前术后的DP值有差异。荧光显微镜下可见 3d组表达产物最高。 7d后逐渐减弱 ,1 0d后更弱 ,表达产物主要分布于支持细胞、螺旋神经节细胞和基底膜下的间皮细胞。对照组均无绿色荧光。结论　通过圆窗或底回注入腺病毒对听阈没有影响。单一位点的接种就能使神经营养因子通过耳蜗液扩散到整个耳蜗。有效的基因转移在耳蜗是可行的 ,但表达相对短暂。     

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。     

品系、性别和生物节律对小鼠旷场实验的影响

目的探讨性别、品系以及昼夜生物节律对旷场实验的影响。方法利用旷场实验检测不同性别的C57BL/6、BALB/c、昆明小鼠在白天与夜间对新环境的探索行为与自发活动能力。结果 3种品系小鼠旷场实验结果显示:C57BL/6在旷场中探索活动和自发活动量最低,显著低于BALB/c和昆明小鼠;C57BL/6雌、雄小鼠在白天和夜晚探索活动和自发活动量未见差异,而BALB/c和昆明小鼠分别在白天和夜间呈现性别差异;C57BL/6雌雄小鼠昼夜探索活动和自发活动量差异均无统计学意义,而BALB/c和昆明雌性小鼠呈现夜间高于白天,雄性小鼠则无此表现。结论 C57BL/6小鼠在新环境中探索活动少,自发活动量低,且受性别、节律因素影响较小,适合用于神经行为学和焦虑相关行为研究。     

咪唑安定对豚鼠噪声性聋的保护作用

目的 通过检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和耳蜗中活性氧含量研究咪唑安定对噪声性聋的保护作用.方法 雄性杂色豚鼠40只,随机分为正常对照组(C组)、咪唑安定组(M组)、生理盐水组(S组)和噪声性聋组(D组),每组10只.M组、S组和D组每天接触倍频程连续噪声(中心频率为4kHz,强度为100dB SPL)3h,连续3d.M组于噪声暴露前24h、即刻及噪声暴露中肌肉注射咪唑安定0.1mg/kg;S组在相同时间肌肉注射等量的生理盐水;D组为单纯接触噪声对照组.C组不接触噪声仅肌肉注射咪唑安定,注射时间及剂量与M组相同.所有动物均于噪声暴露前及暴露后立即检测听性脑干反应(ABR)阈值,在噪声暴露前和噪声暴露第3天处死前,取血测定血清中SOD活性、MDA含量,于第3天测完ABR阈值后,立即断头处死豚鼠,取出双侧耳蜗,测定其活性氧含量.结果 噪声暴露后,M组的ABR阈移(1.6±1.5)及活性氧含量[(291.10±2.30)u/mL]显著低于S组和D组[41.7±3.3,44.3±3.9;(348.52±3.60)u/mL,(315.56±6.70)u/mL, P<0.05].M组在噪声暴露后血清SOD活性下降、MDA含量升高,但其幅度明显小于S组和D组.结论 咪唑安定可减少噪声暴露后耳蜗中增多的活性氧含量,从而产生对噪声性耳蜗损伤的保护作用.     

豚鼠耳蜗血管纹TMEM16A随鼠增龄的表达变化

目的探讨跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A,TMEM16A)在不同鼠龄豚鼠耳蜗血管纹上的表达及其与年龄相关性听力下降之间的关系。方法将健康豚鼠按照年龄分为:2周组、3月组、1年组、D-半乳糖(D-galactose,D-gal)衰老模型组;听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检测不同鼠龄豚鼠的听力变化;免疫荧光技术和免疫印迹实验(Western blot)检测TMEM16A在不同鼠龄豚鼠耳蜗血管纹中的分布和表达改变。结果 ABR反应阈值随鼠龄增长呈逐渐增高趋势,D-gal组与其他3组之间的差异具有统计学意义(P<0.01)。TMEM16A在不同鼠龄豚鼠耳蜗血管纹中均有表达,且表达量从2周组到1年组随鼠龄的增加呈上升趋势(P均<0.05);D-gal组表达量减少,与3月组和1年组均有统计学意义(P<0.05)。结论 TMEM16A在豚鼠耳蜗血管纹表达的变化可能与年龄相关性听力下降相关。     

庆大霉素中毒豚鼠蜗核SP免疫反应阳性神经元的变化

用免疫组化方法探讨庆大霉素耳中毒时蜗核ＳＰ免疫反应神经元的胞体截面积及细胞数的变化。结果发现庆大霉素１００ｍ ｇ·ｋｇ－ １·ｄ－ １腹腔注射后１ｄ,豚鼠蜗核ＳＰ样神经元胞体截面积立即发生了变化,并持续到连续注药第２１ 天;ＳＰ样神经元细胞数量的相对变化发生在注药３ｄ 以后。结果提示：①庆大霉素中毒豚鼠蜗核神经元的变化和耳蜗的病变可能同时发生或蜗核早于耳蜗病变。②临床上治疗氨基甙类抗生素所致耳聋应兼治中枢病变并尽早实施     

地塞米松治疗自身免疫性感音神经性耳聋的实验研究

本实验应用豚鼠内耳母抗原液免疫豚鼠产生自身免疫性感音神经性耳聋(AISNHL),后用地塞米松治疗1周,并行听觉脑干诱发电位阈(ABRT)测定和内耳形态学观察。我们发现免疫后豚鼠ABRT升高到60.8±531dBSPL、耳蜗第3回外毛细胞损失达111.0±55.8个;而应用地塞米松治疗后的豚鼠ABRT则下降为48.8±6.69dBSPL。耳蜗第3回外毛细胞损失仅为57.25±18个,证实地塞米松对AISNHL有治疗效果,它可使内耳组织恢复,ABRT明显改善,其机制尚不明了。     

Mammalin cochlear supporting cells transdifferentiation into outer hair cells

Objective To study the recovery of the outer hair cells in the bat cochlea after gentamicin exposure.Methods Bats were injected with a daily dose of gentamicin for 15 consecutive days and bromodeoxyuridine (BrdU)was given from day 16 to day 40 of this recovery phase. Hearing was assessed by overt acoustic behavior and auditory brainstem responses analysis, which was performed one day prior to the first injection and a day after the last injection (day 16). On day 40 animals were sacrificed for detection of cells that could take up BrdU. Results After 15 days of gentamicin treatment, all of the animals were proved to be deafened with significant increases of ABR thresholds,compared with control group. The findings in immunocytochemical stained samples and scanning electron microscopy revealed that BrdU labeled nuclei were observed in the cochlea in all of the deafened animals most commonly in the regions of the first-row and second-row Deiter's cells (DCs) and occasionally in the regions of the third-ruw DCs.Conclusion We suggest that, under sufficient drug and enough time, the bat cochlear supporting cells can directly transdifferentiate into the outer hair cells after aminoglycoside exposure. This transdifferentation process is essential for repair of outer hair cells and recovery of normal function after gentamicin exposure.     

中强白噪声对螺旋器毛细胞有氧代谢的影响——动物试验研究之二

<正> 耳蜗螺旋器感觉毛细胞,分化程度高,代谢旺盛。一些研究者认为,在声响过度刺激时,其代谢首先枯竭,进而发生功能和形态变化。众所周知,细胞的活动需从氧代谢摄取能量,而后者却要受到有关酶的催化。所以根据氧化还原酶的活性就可以间接判断细胞代谢的程度。参与氧化的酶很多,琥珀酸脱氢酶(Succinic Dehydrogenase:SDH)乃其中之一。因能用组织化学方法间接而特异地在细胞中进行定位和定量,故常被用作研究组织有氧代谢     

HAIR CELL-LIKE CELL GENERATION INDUCED BY NATURE CULTURE OF ADULT RAT AUDITORY EPITHELIUM

Objective To establish adult rat auditory epithelial cell culture and try to find precursor cells of auditory hair cells in vitro. Methods With refinement of culture media and techniques, cochlear sensory epithelial cells of adult rat were cultured. Immunocytochemistry and Bromodeoxyuridine （BrdU） labeling were used to detect properties and mitotic status of cultured cells. Results The cultured auditory epithelial cells showed a large, flat epithelial morphotype and expressed F-actin and cytokeratin, a subset of cells generated from auditory epithelium were labeled by calretinin, a specific marker of early hair cell. Conclusion Adult rat auditory epithelium can be induced to generate hair cell-like cells by nature culture, this phenomenon suggests that progenitor cells may exist in rat cochlea and they may give birth to new hair cells. Whether these progenitor cells are tissue specific stem cells is still need more study.     

化脓性中耳炎豚鼠耳蜗血管纹Na~＋，K~＋－ATP酶活性的改变

鼓泡内接种金黄色葡萄球菌，诱发豚鼠急性化脓性中耳炎。应用ＮＰＰ酶组织细胞化学方法进行孵育反应。电镜下观察耳蜗底回血管纹Ｎａ＋，Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性的改变。结果发现血管纹Ｎａ＋，Ｋ＋－ＡＴＰ酶主要分布于边缘细胞基底侧膜的皱褶处；且酶的活性随病程的延长而逐渐降低。实验结果表明：血管纹离子泵功能的损害是化脓性中耳炎致感音神经性聋的原因之一。