同一膀胱癌的三个亚细胞株和BIU-87膀胱癌细胞株的化疗药物敏感性研究

用未经化疗的同一膀胱癌手术标本建立的三株膀胱癌细胞株 (BL Z2 11、BL S2 11、BL X2 11)和人膀胱移行细胞癌细胞株 BIU- 87进行了氟尿啶啶 (5- Fu)、顺氯氨铂 (CDDP)、和长春新碱 (VCR)的敏感性试验。结果表明 :四株膀胱癌细胞株对这三种化疗药物的敏感性存在差异。当药物浓度分别为其临床用量的计算值时 ,BL Z2 11细胞株对 5- Fu高度敏感 ,与其它三株细胞的敏感性存在显著差异(P <0 .0 5) ;四株细胞对 CDDP均敏感 ;对 VCR四株细胞均耐药。提示 :对化疗敏感性的差异不仅存在于不同的肿瘤病人 ,而且也存在同一肿瘤标本的不同细胞群体中。因此 ,化疗前进行药敏试验 ,实行用药个体化对提高疗效有重要作用。     

三株新建人膀胱癌细胞系染色体畸变特点

应用G-显带技术对来源于同一膀胱癌手术标本的三株新建的克隆性膀胱癌细胞系（BLZ211，BLX211和BLS211）的核型进行分析，发现所有的核型均为超二倍体，染色体众数分别是63、62和69；每个细胞都缺失一条9号染色体，7号染色体多为三条或四条；每个细胞系都有五个固定出现的异常染色体，其中四条是三个细胞系共有的：①4号染色体的结构重排，4pter→4q35：：？，②9号染色体臂间倒位，inv（9）（p21q22），③2个不能识别的标记染色体．M3和M4。本文研究结果表明9号和7号染色体改变是这三株人膀胱癌细胞的原发染色体畸变。     

基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因C1反式调节基因

目的对未知功能基因C1转染人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)后的基因表达谱进行分析,探索该基因的表达对肝细胞基因表达谱的影响及其可能的调节功能线索。方法以分子生物学技术构建C1的真核表达载体pcDNA3.1(-)-C1,以表达质粒pcDNA3.1(-)-C1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果HepG2细胞经转染C1表达质粒后,有26条差异表达基因,其中24条基因表达水平下调,2条基因表达水平上调。这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、细胞增生分化及肿瘤的发生密切相关。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了C1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明C1蛋白可能的生物学功能及乙型肝炎病毒核心蛋白的致病机制提供了理论依据。     

MICROARRAY ANALYSIS OF DIFFERENT GENE EXPRESSION OF HUMAN CERVICAL CANCER SUBCLONE CELL LINES

Objective To examine the differentially expressed invasion-related genes in two anchorage-independent uterine cervical carcinoma cell lines derived from the same patient using a cDNA array. Methods Two human uterine cervical carcinoma subclonal cell lines CS03 and CS07 derived from a single donor line CS1213 were established by limited dilution procedure. The two cDNA samples retro-transcribed from total RNA derived from CS03 and CS07 cells were screened by a cDNA microarray carrying 234 human cell-cycle related genes and 1011 human signal transduction and membrane receptor -associated genes, scanned with a ScanArray 3000 laser scanner. Results The cDNA microarray analysis showed that ]2 genes in CS03 were up-regulated compared to CS07, and 24 genes in CS07 were upregulated. The function of a number of differentially expressed genes was consistently associated with cell-cycle, cell proliferation, migration, apoptusis, signal transduction and tumor metastasis, including p34^cdc2, TSC22, plasminogen activator inhibitor Ⅰ （PAI-1）and desmusome associated protein（Pinin）. Conclusion Multiple genes are differentially expressed in uterine cervical carcinoma cell lines even came from the same patient. It is suggested that these genes are involved in the different phenotypic characteristics and development of cervical carcinoma.     

三个膀胱癌细胞系侵袭相关分子的研究

目的　探讨膀胱癌细胞侵袭能力不同的机制。方法　取来源于同一膀胱癌组织的三个细胞系 ,检测其软琼脂克隆形成率及基底膜黏附能力。采用荧光偏振法测定细胞膜脂流动性 ,免疫组化法和流式细胞术分析E cadherin、基质金属蛋白酶 2 (matrixmetalloproteinases 2 ,MMP 2 )和CD44的表达。 结果　BLX和BLZ细胞的软琼脂克隆形成率高于BLS细胞 ,同时基底膜黏附能力均大于BLS细胞 ,BLX和BLZ细胞的膜脂流动性小于BLS细胞 ,BLX、BLZ和BLS细胞在MMP 2表达上无差异 ,BLS和BLZ的E cadherin表达强于BLX细胞。流式细胞仪分析BLS细胞CD44阳性率高于BLX和BLZ细胞。结论　膀胱癌细胞系在侵袭能力上的差异可能与其膜脂流动性及CD44的表达不同有关     

生物信息学方法大规模筛选肿瘤差异表达基因

目的 利用数据库中已有的基因信息快速筛选鉴定出潜在的肿瘤相关基因.方法 利用EST数据库中的基因信息,采用数字化差异显示(DDD)方法,对17种不同肿瘤组织的全基因组进行筛选.结果 获得了130个上调基因和159个下调基因,大多为编码细胞骨架蛋白、核糖体亚单位的基因以及与物质代谢、细胞周期、信号传导、调节转录和翻译过程有密切关系的基因.这些基因在12号染色体上出现频率最高,而在21号和Y染色体上很少出现.结论 生物信息学筛选是一种快速有效的筛选方法.本实验所得结果对今后肿瘤标志物的鉴定奠定了基础,也为肿瘤标志物的筛选策略提供了新的思路.     

人膀胱移行细胞癌细胞株BLZ-211的生物学特性

以膀胱移行细胞癌患者的肿瘤标本为材料建立了１株克隆性膀胱癌细胞株ＢＬＺ－２１１,体外培养３年多,传代１５０次,没有支原体污染。生物学特性鉴定：光镜和超微结构显示该细胞具有膀胱移行细胞癌细胞特征。细胞接种裸鼠形成的移植肿瘤与手术标本病理形态一致。染色体众数６３,有特异性的ＬＤＨ同功酶谱,有ｐ１６基因的正常扩增条带。结果提示ＢＬＺ－２１１细胞株是一个研究人膀胱移行细胞癌细胞生物学的实用模型。     

放射抗拒性鼻咽癌细胞系的建立及差异表达基因

目的 筛选同一来源放射敏感性不同鼻咽癌细胞基因差异表达,探讨鼻咽癌放射抗拒机理.方法 用X射线间歇多次照射鼻咽癌细胞株CNE-2建立放射抗拒性细胞CNE-2R,采用BioStarH-141s型基因芯片检测CNE-2与CNE-2R差异表达基因.结果 CNE-2和CNE-2R细胞有差异表达的基因308条,上调176个,下调132个.在差异表达的基因中,有76个位点出现6倍以上的差异,其中36个下调、40个上调,包括与DNA修复相关、细胞周期、凋亡、细胞骨架相关蛋白、细胞增殖、代谢、蛋白质合成、信号转导、免疫相关等方面相关的基因,基因分布变化较明显的主要是DNA修复相关基因、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因.结论 CNE-2细胞反复照射后产生放射抗拒性细胞,在基因水平上发生了某些突变,通过调控其中相关基因,就有可能调控细胞的放射敏感性.     

基于敏感编码技术磁共振水成像在胃肠道检查中的应用

目的探讨基于敏感编码(SENSE)技术单次激发放射状水成像技术对正常胃肠道解剖结构的显示能力,为水成像技术诊断胃肠道疾病提供正常解剖学基础,并探讨胃肠道疾病的影像学诊断新方法。方法健康自愿者共30例,其中男性19例,女性11例,年龄20-50岁,中位年龄35岁。检查前60 min口服饮用水1 000-1 500 mL,检查前20 min再口服500 mL,扫描前10 min肌注654-2 10 mg。MR水成像(MRH)检查使用PhilipsGyroscan Intera 1.5T超导型MRI,采用SENSE技术相匹配的相控阵线圈及呼吸门控,行单次激发放射状快速自旋回波序列进行胃肠道水成像检查。结果30例均能接受此检查,检查成功率100%。30例水成像图像经盲法评价,优良图像占93%,差图像占7%。其中胃显示率65%,胃黏膜显示清楚占80%;十二指肠显示率80%,空肠显示率59%,空肠直径2-2.5 cm,回肠显示率21%,回肠直径1.5-2.5 cm,小肠黏膜清楚显示占67%;结肠显示率10%,结肠黏膜清楚显示占6%。结论基于SENSE技术单次激发放射状水成像技术对胃、十二指肠及空肠轮廓和黏膜皱襞显示较为清楚,对回肠及结肠轮廓和黏膜皱襞显示较差。单次激发放射状水成像技术结合常规腹部MR检查可以清楚、方便地显示胃肠道的解剖特点,是胃肠道影像学检查的一种新的可供选择的方法。     

基因芯片技术在COX10等无精症患者相关基因的分析

目的　运用基因芯片技术获取正常生育者睾丸组织与无精症患者睾丸组织中差异表达的基因 ,并对结果进行生物信息学分析。方法　分别抽提正常生育者与无精症患者睾丸组织中mRNA制备探针 ,应用基因芯片技术观察二者表达谱差异情况 ,并对其中明显下调的COX10基因进行生物信息学分析。结果　通过人基因芯片筛选 ,获得 12 0条与无精症相关的基因 ,其中明显下调的基因COX10与人类精子调控关系密切。结论　基因芯片筛选正常生育者与无精症患者睾丸组织差异表达基因具有样品用量少 ,高敏感性 ,快速高效等特性 ,可用于筛选和研究无精症相关基因     

DIFFERENTIAL EXPRESSION OF GENES IN OMENTAL FAT OF NORMAL WEIGHT AND OBESE SUBJECTS AND OBESE DIABETIC PATIENTS USING cDNA MICROARRAY

Objective To identify genes differentially expressed in omental fat of normal weight subjects,obese subjects and obese diabetic patients. Methods Using a high-density cDNA microarray, gene expression profile of omental fat from normal weigh subjects, obese subjects and obese diabetic patients were compared.Results Totally, 119 and 257 genes were up-regulated in obese subjects and obese diabetic patients respectively,while 46 and 58 genes were down-regulated. A total of 77 genes, including PDK4, which switched from carbohydrate to fatty acids as the primary source of fuel, were up-regulated in both obese and obese diabetic patients, while 8 genes, including key enzymes in lipid synthesis, such as HMG-CoA synthase, fatty acid synthase and stearoyl-CoA desaturase, were down-regulated in both groups. Tyrosine-3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein θ ( YWHAZ) , a negative regulator for insulin signal transduction, was up-regulated only in obese diabetic patient, but not in normal-glycemic obese subjects. Conclusion The study demonstrated that decrease of lipogenesis along with increase of fatty acids oxidation of adipose tissue could be a common cause of insulin resistance in obesity and type 2 diabetes, while block of insulin signal transduction may trigger the transition from obesity to diabetes. Further exploration of these genes will be useful in the understanding of the pathogenesis of obesity and diabetes.     

辛伐他汀对人慢性粒细胞白血病细胞K562基因表达的影响

目的应用基因芯片技术研究辛伐他汀对K562细胞基因表达的影响,初步探讨其作用机理。方法辛伐他汀作用K562细胞48h后,提取细胞总RNA。纯化mRNA后再逆转录为cDNA,将cDNA在体外转录合成cRNA,用随机引物反转录为cDNA,用Klenow酶标记Cy3、Cy5,与定制的包含人全基因组的基因芯片杂交,扫描芯片荧光信号,用GenePixPro4.0图像分析软件对芯片图像进行分析。定量RT-PCR验证芯片结果中两个差异表达基因。结果基因芯片检测发现共有176条基因表达发生明显改变,包括16条未知基因表达改变。其中151条基因表达上调,25条基因表达下调。根据基因功能的不同,我们初步将其分为凋亡相关、信号转导相关、细胞周期相关等几大类。定量RT-PCR验证的基因表达变化趋势与表达谱芯片的结果相吻合。结论辛伐他汀作用K562细胞后能引起多种基因表达改变,这为探讨其作用机制提供了新的依据。     

人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的差异蛋白质组学研究

目的应用蛋白质组学技术探讨人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质差异表达谱,筛选肝细胞癌的特异性标志物。方法应用双向电泳(2-DE)方法对细胞总蛋白进行分离和分析,用质谱(MS)鉴定差异表达蛋白,并用免疫组化方法验证部分差异表达蛋白。结果与7702细胞相比,在HepG2细胞中鉴定出17种差异表达蛋白,10种上调,7种下调,主要涉及物质代谢酶和抗凋亡、调节应激和细胞间信号传导的蛋白质;免疫组化结果验证了膜联蛋白A1(annexin A1)和亲环蛋白A(cyclophilin A)在肝细胞癌病理组织中均明显上调,且主要定位于胞质内。结论人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞7702的蛋白质表达差异显著,其中膜联蛋白A1和亲环蛋白A可作为肝细胞癌诊断及治疗的分子标志物。     

肝细胞肝癌患者的血清蛋白质组学研究

目的分析肝细胞肝癌患者的血清蛋白质谱,寻找诊断肝癌和检测治疗的特异性标志物。方法收集了50例肝癌患者血清,在去除血清中6种高丰度蛋白后进行双向凝胶电泳分离及银染,将凝胶扫描图像与正常人血清比较分析,然后经质谱鉴定20个差异表达蛋白质点。结果共鉴定了11种差异表达蛋白质,其中7种蛋白质在肝癌患者血清中表达水平上调,其余4种蛋白质表达水平下调。有7个点被同时鉴定为α1-抗胰蛋白酶,均在肝癌患者血清中表达上调,提示α1-抗胰蛋白酶在肝癌中降解加快。Western blotting检测进一步证实多数肝癌血清中的α1-抗胰蛋白酶小片段增多。结论血清是诊断肝癌和检测治疗非常重要的临床标本,本实验中鉴定的蛋白质虽不能作为临床诊断标志物,但对分析肝癌血清蛋白谱的改变有一定的参考价值。     

三阴性乳腺癌差异表达miRNA的筛选

目的应用miRNA芯片技术筛选三阴性乳腺癌及癌旁组织差异表达的miRNAs,为进一步阐明其在三阴性乳腺癌发病机制中的作用奠定基础。方法收集8例新鲜的三阴性乳腺癌及其癌旁组织,抽提总RNA进行Hy3荧光标记,miRCURYTMLNA Array(v.16.0)(Exiqon)芯片上进行杂交反应,实时定量PCR验证miRNAs芯片结果的可靠性。结果对芯片进行图像扫描和数据分析,筛选获得17个三阴性乳腺癌相关miRNAs,其中7个miRNAs表达上调,10个miRNAs表达下调;显著上调的有miR-93、miR-328,显著下调的有miR-145、miR-205。结论筛选得到三阴性乳腺癌miRNA差异表达谱,其可能与三阴性乳腺癌的发生发展有关。     

不同表型的人宫颈癌细胞亚克隆株的基因表达谱

目的　采用基因芯片技术分析同一人宫颈癌细胞株来源 ,锚着依赖性不同的两个亚克隆细胞株的侵袭相关基因表达。方法　采用有限稀释法建立CS12 13细胞的CS0 3和CS0 7亚克隆细胞株 ,检测其在软琼脂中的集落形成率 ,分别用流式细胞术和免疫组化法观察细胞黏附分子CD4 4和E cadherin、Fibronetin的表达 ,并将CS0 3和CS0 7细胞的总RNA经逆转录获得的cDNA作为探针 ,与含 10 11个与细胞信号转导和细胞膜受体相关基因表达谱芯片杂交 ,信号用ScanArray 30 0 0扫描分析。结果　CS0 3和CS0 7细胞的集落形成率分别是 0和 38.5 % ,CD4 4表达分别是 35 .1%和 13.7% ;两者的基因表达谱差异明显 ,CS0 3细胞中表达上调的基因为 12个 ,CS0 7细胞中有 2 1个基因表达增加 ,其中一些与细胞增生、迁移、凋亡 ,细胞间信号传导和肿瘤转移相关 ,包括p34cdc2 、转化生长因子 β刺激蛋白 (TSC2 2 )、纤维蛋白酶原活性因子抑制剂 (PAI 1)和桥粒相关蛋白 (PININ)等。结论　同一来源的人宫颈癌细胞株中有多个差异表达基因 ,它们参与人宫颈癌细胞的表型特征 ,可能影响肿瘤的进展。     

大鼠Barrett食管癌变相关基因的初步筛选

目的初步筛选大鼠Barrett食管(Barrettsesophagus,BE)癌变相关基因。方法建立胃十二指肠食管反流SD大鼠动物模型,用含有4096条双点大鼠cDNA芯片分别比较BE、食管腺癌(esophagealadenocarcinoma,EA)与正常食管上皮(normalcontrol,NC)mRNA差异表达情况。结果芯片杂交差异表达在3倍以上的基因:EA和NC杂交芯片377项,其中上调表达90条,下调表达142条;BE和NC杂交芯片448项,其中上调表达312条,下调表达136条。相对于BE,EA表达上调的基因112条,下调156条。与肿瘤发生相关的已知基因24条,上调18条,下调6条。结论与BE比较,EA基因表达谱发生了明显改变,与肿瘤发生相关的基因改变明显,差异表达的基因可能与肿瘤的发生相关。     

人UCA1基因新剪接变异体全长cDNA序列的克隆

目的克隆新的UCA1剪接变异体全长cDNA序列,为研究其可变剪接机制奠定基础。方法用电子克隆技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增细胞系BLZ-211cDNA并进行产物测序和序列拼接。结果新克隆的UCA1剪接变异体全长cDNA序列为2 202bp。结论综合采用电子克隆技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法,为该基因的后续可变剪接机制的研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

Proteomics Related to Resistance to the Cucumber Powdery Mildew Disease in F2Generation of Cucumber

Cucumber powdery mildew disease caused bySphaerotheca fuliginea is a serious disease of culti-vated cucumber in most cucumber-growing regionsof the world. Understanding resistant mechanismof cucumber against powdery mildew disease is in-creasingly crucial for breeding resistant cultivars toeffectively overcome the disease. In the case, agreat deal of researches on single proteins or en-zymes encoded by the resistant genes have beenperformed to uncover defense mechanism. Howev-er, so far there …