逆转录病毒介导CXCR4-siRNA对前列腺癌细胞体外侵袭能力的影响

目的设计构建趋化因子受体4(CXCR4)的RNA干扰逆转录病毒载体,探讨干扰CXCR4表达对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。方法用PCR扩增CXCR4特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的Pgensil-1质粒中,再将重组基因片段导入到逆转录病毒真核表达载体PLX-SN中,行限制性酶切及测序鉴定。重组逆转录病毒载体转染包装细胞PA317,获取病毒上清转染前列腺癌细胞,RT-PCR检测CXCR4mRNA表达。Transwell小室侵袭实验检测前列腺癌细胞体外侵袭能力的变化。结果通过酶切及测序鉴定,成功构建了PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4。干扰质粒抑制CXCR4mRNA的表达,与空载体组比较,PC-3m、LNCaPsiRNA对CXCR4mRNA的抑制率分别为(84.26±10.20)%和(88.17±11.23)%。Transwell侵袭实验结果显示,干扰组微膜下孔细胞数PC-3m、LNCaP分别为(14.7±3.1)和(18.9±4.2)个,空载体组分别为(46.9±5.3)和(66.7±6.0)个,两者差异显著(P<0.05)。结论PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4可以有效地抑制前列腺癌细胞CXCR4mRNA的表达,干扰CXCR4可以显著抑制前列腺癌细胞体外侵袭转移能力。     

肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体的构建

目的 构建肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体.方法 PCR扩增Survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定.体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA并酶切、测序鉴定.用Survivin启动子替换pGenesil-FAK shRNA中的U6启动子,重组为Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体pGenesil-pSurv-FAK shRNA.将pGenesil-pSurvFAK shRNA转染至肝癌细胞系HepG2,观察转染效率.48h后应用RT-PCR法检测转染重组质粒后HepG2细胞中FAK mRNA的表达变化.结果 成功构建了肿瘤特异性Survivin启动子驱动的真核表达载体pGenesil-pSur-FAKshRNA,转染至肝癌细胞HepG2后可明显下调HepG2细胞中FAK mRNA表达水平.结论 以Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体能够有效下调肝癌细胞FAK的表达,为进一步以靶向干扰FAK表达为主要手段的肝癌联合治疗提供实验依据.     

SLC-Her-2/neu-p53-Fc融合基因重组腺病毒真核表达载体对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果

目的扩增纯化携带融合基因SLC-Her-2/neu-p53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体,研究其对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果。方法将重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc在人胚肾293细胞中扩增、纯化;向小鼠皮下注射表达Her-2/neu-p53融合基因的B16F10-psig-Her-2/neu-p53细胞(B16-HP细胞)建立荷黑色素瘤小鼠模型;将小鼠随机分成对照组、肌肉注射组和皮下注射组,用重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体进行治疗,观察肿瘤生长情况,测定细胞毒性活性、血清p53抗体。结果纯化后重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体滴度8×108pfu/mL。目的基因SLC-HP在小鼠体内成功表达。重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能有效抑制小鼠肿瘤的生长,瘤重与对照组比较差异有统计学意义(P=0.005),抑瘤率达到98.8%,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤力有明显提高。结论重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能延长出瘤时间,抑制肿瘤的生长。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

人白介素17受体样分子的克隆及表达

目的　构建带有 6×myc的人白介素 17受体样分子的重组表达质粒 ,以便检测hIL 17RLM L基因在真核细胞中的特异性表达。方法　设计带有酶切位点 (EcoRⅠ和XhoⅠ )的特异性引物 ,用PCR方法扩增hIL 17RLM L片段回收后插入带有 6×myc标签的 pcDNA3.0真核表达载体 ,转染COS7细胞后作Westernblot检测其表达。结果　成功地构建了带有 6×myc标签的 pcDNA3.0 6×myc /hIL 17RLM L重组质粒 ,Westernblot检测到该质粒可在真核细胞中表达。结论　用分子生物学的方法成功地构建了真核表达质粒pcDNA3.0 6×myc /hIL 17RLM L ,使该基因的特异性检测成为可能 ,为进一步研究hIL 17RLM L的生物学功能奠定了基础。     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

目的 克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因,构建重组真核表达质粒,获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白.方法 应用RT-PCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RT-PCR鉴定基因转录,用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白.结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因,表达蛋白具有免疫活性.结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达.     

脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.     

靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P<0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2%,蛋白表达下调68.2%(P<0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。     

CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF EUKARYOTIC VECTOR EXPRESSING SIRNA SPECIFIC FOR BACE

TheAlzheimer sdisease(AD)isaseriousde generativediseaseandmanifestedthedepositionof amyloid peptide(Aβ)intosenileplaquesintheex tracellularspaceandthehyperphosphorylationoftau proteincausingneurofibrillarytangles[1].RNAinterference(RNAi)isanancientevolu …     

饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达

目的　通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法　应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段 ,并克隆到pUC1 9载体中 ,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列 ,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX 4T 1表达载体中 ,经BamHI和EcoRI双酶切后 1 2 %凝胶电泳鉴定 ,IPTG诱导表达产物经SDS PAGE分析。结果　克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF1 3830 0记载的序列完全一致 ,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65 6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论　本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST Decorin融合蛋白     

HPV-6/11 L1/E6、HPV-6/11 L1/E7嵌合DNA疫苗质粒的构建

目的　构建HPV 6 / 11L1/E6、HPV 6 / 11L1/E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法　运用PCR扩增HPV 6 /11L1、E6、E7序列 ,PCR产物连接至pGEMT Easy质粒 ,测序鉴定正确后 ,分别连接至真核表达载体pVAX ,再用酶切、连接而构建成HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX质粒。运用电穿孔法将所获得质粒转染COS 7细胞 ,免疫组化检测蛋白表达情况。结果　所构建质粒的插入目的片段测序正确 ;免疫组化检测在胞浆胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论　所构建的HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX融合蛋白表达质粒可在体外表达L1 E6 /L1 E7蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的动物实验及临床实验研究做好准备     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

人U_6启动子表达载体的构建及在胃癌细胞中的活性鉴定

目的构建人U6(hU6)snRNA启动子驱动的小RNA分子的表达载体,并在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞中鉴定其表达外源性小RNA分子的活性。方法以人基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hU6snRNA启动子序列,并将其克隆入PUC19载体中,命名为PUC-hU6-extra,经测序证明其序列的正确性;用脂质体法转染SGC-7901细胞;用RT-PCR检测U6启动子的转录活性,并测定培养细胞的生长曲线。结果hU6snRNA基因启动子和紧接转录起始点hU6snRNA的前27个核苷酸被成功地克隆入PUC19质粒载体,重组载体在SGC-7901细胞中能高表达小分子RNA,并且未观察到后者对细胞体外增殖的影响。结论成功构建了以hU6snRNA启动子驱动的、能在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞内高效转录小分子RNA的表达质粒PUC-hU6-extra。     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　将具有全长血小板生成素 (TPO)活性的N端截短血小板生成素cDNA(T1 84)作为目的基因 ,在中华仓鼠卵巢细胞 (CHO)中成功表达。方法　将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶 (DHFR)为筛选扩增基因的 pDC B真核表达载体 ,通过不断提高MTX浓度 ,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果　构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒 ,并能在CHO细胞中高效表达。结论　N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达 ,其产物具有全长TPO的活性。     

Fas靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的　构建Fas靶向的RNA干扰质粒载体,为探讨抑制Fas表达在急性再生障碍性贫血治疗中的意义奠定基础。方法　PCR法获得U6启动子序列以及产生siRNA的相应DNA模板序列,将其克隆入改造后的pcDNA3.1,获得RNA干扰载体pU6 siFas。脂质体法将pU6 siFas导入P815 细胞,免疫组化法检测对P815 细胞Fas表达的抑制情况。结果　所构建的载体pU6 siFas能够干扰P815细胞中Fas的表达,并且具有新霉素抗性,能够用G 418 筛选稳定转化的细胞株。结论　成功构建了抑制小鼠Fas表达的RNA干扰质粒载体。