抑制CXCR4基因调控Wnt/β-catenin通路在卵巢癌转移中的作用

目的研究趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)在卵巢癌转移中的作用及其机制。方法采用Real-time PCR和Western blot法检测正常卵巢组织、卵巢癌组织和卵巢癌细胞株(CAOV3)CXCR4mRNA和蛋白的表达以及CXCR4shRNA转染后卵巢癌CAOV3中CXCR4mRNA和蛋白的表达;MTT法检测CXCR4shRNA对卵巢癌细胞增殖的影响;通过Transwell侵袭实验检测CXCR4基因沉默对卵巢癌细胞侵袭性的作用;Real-time PCR法检测CXCR4shRNA转染后Wnt/β-catenin通路相关基因和EMT相关基因的mRNA表达。结果 CXCR4在卵巢癌组织和CAOV3细胞中的表达明显高于正常卵巢组织;转染CXCR4shRNA可有效抑制CAOV3细胞中CXCR4mRNA和蛋白表达;CXCR4基因沉默可有效抑制细胞增殖、降低细胞侵袭性;同时明显抑制Wnt/β-catenin通路相关基因CTNNBI、C-MYC、MMP-9和CD44以及EMT相关基因SLUG和Vimentin的mRNA表达。结论 CXCR4通过调控Wnt/β-catenin通路影响卵巢癌的转移。     

沉默IFITM1基因对卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨siRNA沉默IFITM1基因表达对卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭的影响。方法利用脂质体转染法将靶向IFITM1的小干扰RNA(siRNA)转染卵巢癌细胞株CP70;qRT-PCR和Western blot观察转染后CP70细胞IFITM1mRNA和蛋白表达的变化;平板克隆形成实验和Transwell小室分别检测各组细胞增殖和侵袭能力的变化。结果转染组CP70细胞的IFITM1mRNA和蛋白表达明显受抑制;转染组、阴性对照组及转染试剂对照组形成克隆数分别为84、181、178,克隆形成率分别为42%、90.5%、89%,迁移出的细胞分别约为59个、121个、126个,转染组结果与其他两组之间有统计学差异,说明转染IFITM1siRNA抑制了卵巢癌CP70细胞增殖和侵袭能力。结论沉默IFITM1可以降低卵巢癌细胞的增殖和侵袭能力,IFITM1可能成为卵巢癌治疗的潜在新靶点。     

β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR扩增BACE特异性小干扰RNA,转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒,再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE。结论pLXSN/EGFP-U6-siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。     

CXCL12/CXCR4轴在胰腺癌-神经交互作用中的研究

目的本研究旨在阐述CXCLl2/CXCR4轴对胰腺癌神经相互作用的影响,探讨CXCLl2/CXCR4在胰腺癌嗜神经过程中的相关分子机制。方法体外培养胰腺癌Panc-1、Miapaca-2细胞,实验分为空白对照组、外源性CXCLl2组及CXCR4受体特异性阻断剂AMD3100组。采用RT-PCR检测胰腺癌细胞CXCR4及CXCL12mRNA的表达,检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)及人尿激酶型纤溶酶原激活物(human urokinase plasminogen activator,uPA)mRNA的表达;采用Transwell侵袭实验观察各实验组中细胞侵袭性的变化;提取大乳鼠脊髓背根神经节,建立胰腺癌细胞Miapaca-2与脊髓背根神经节(DRG)共培养模型,倒置显微镜成像系统动态观察不同实验组中神经轴突生长差异。结果胰腺癌细胞Panc-1、Miapaca-2细胞存在CXCR4mRNA的表达,而CXCL12mRNA无表达;两种胰腺癌细胞之MMP-2、MMP-9及uPAmRNA在AMD3100组、对照组、CXCLl2组中的表达差异具有统计学意义(P<0.01);Transwell细胞侵袭性实验中,外源性CXCLl2明显增强Panc-1、Miapaca-2细胞的侵袭性,而AMD3100有效抑制肿瘤细胞的侵袭能力,组间存在显著差异(P<0.05)。胰腺癌细胞与脊髓背根神经节共培养模型中,外源性CXCLl2明显增强神经轴突的生长,促使胰腺癌细胞与神经轴突接触,而AMD3100有效抑制神经轴突生长及与肿瘤细胞接触;细胞共培养144h后各组神经生长轴突数差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CXCLl2/CXCR4一方面增强胰腺癌细胞的侵袭能力,促进胰腺癌细胞神经浸润;另一方面,神经元与施万细胞等构成神经纤维分泌CXCL12并通过化学趋化作用,诱导表达CXCR4的胰腺癌细胞向神经迁移,导致神经浸润的发生。     

CXCR7-shRNA靶向抑制结肠癌SW620细胞的体外实验研究

目的探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法①设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;②将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验的表达载体;③MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;④细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;⑤Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果①测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别3.16×108pfu/mL、4.27×108 pfu/mL、3.93×108pfu/mL和2.95×108pfu/mL;②3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P<0.05);③CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有统计学差异(P<0.05);④SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,差异有统计学意义(P<0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,差异有统计学意义(P<0.05);⑤CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论 CXCR7被沉默后可有效抑制SW620肿瘤细胞的增殖与迁移,这为后续研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的肿瘤基因治疗打下良好基础。     

miR-498通过下调FOXM1抑制肺腺癌细胞系A549的迁移侵袭

目的探索微小RNA498(miR-498)是否通过下调FOXM1抑制肺癌细胞系(A549)细胞的迁移和侵袭。方法转染miR-498mimic和miR-NC至培养的A549细胞中,Western blot检测A549细胞中COL1A1、COL1A5、FOXM1的表达情况,划痕试验和Transwell法观察细胞迁移侵袭情况,荧光素酶试验验证FOXM1是miR-498的靶基因;再通过转染过表达FOXM1的质粒至已成功转染miR-498的A549细胞中,检测A549细胞中COL1A1、COL1A5、FOXM1的表达情况,划痕试验和Transwell法观察细胞迁移侵袭情况。结果与空质粒组比较,转染miR-498mimic的A549细胞中COL1A1、COL1A5、FOXM1的表达减少(P<0.05),A549细胞的迁移侵袭减少(P<0.01);荧光素酶实验结果显示,miR-498能够显著降低FOXM1-3′-UTR质粒的荧光素活性(P<0.05);与miR-498+空质粒组比较,转染过表达FOXM1质粒的A549细胞中COL1A1、COL1A5表达增加(P<0.05),细胞的迁移侵袭增加(P<0.01)。结论miR-498可以通过下调FOXM1而抑制A549的迁移和侵袭。     

KLF5转录因子抑制TRAIL诱导PC-3前列腺癌细胞凋亡的分子机制

目的探究通过抑制KLF5表达促进TRAIL诱导的前列腺癌PC-3细胞凋亡的分子机制。方法在TRAIL诱导下,使用MTT实验、流式细胞实验、Western blot及qRT-PCR检测KLF5敲低组与对照组的PC-3细胞在细胞活性、凋亡比例及凋亡相关标志物的表达。结果在PC-3细胞中抑制KLF5表达后,TRAIL诱导下的细胞凋亡明显增加,TRAIL受体DR4、DR5表达上升,凋亡抑制因子c-FLIP蛋白表达下调,但是其mRNA表达水平不变。结论抑制KLF5,可以通过上调TRAIL受体、下调c-FLIP蛋白表达的途径,促进TRAIL诱导的前列腺癌PC-3细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。使用小干扰RNA或小分子药物抑制KLF5表达,可能是潜在的激素非敏感前列腺癌治疗手段。     

趋化因子受体CXCR7协同CXCR4调控胰腺癌趋向性转移及上皮间质转分化

目的探究CXCL12/CXCR4/CXCR7生物轴在胰腺癌细胞侵袭转移及上皮间质转分化(EMT)中的调控作用及其作用机制,为胰腺癌转移的治疗研究提供新依据。方法利用CXCR4 shRNA及CXCR7 shRNA分别构建低表达CXCR4和CXCR7的胰腺癌细胞株。通过细胞侵袭和细胞迁移实验,观察CXCR4、CXCR7对CXCL12诱导的胰腺癌细胞侵袭转移的影响;Transwell侵袭实验及Western blot法检测间接共培养条件下胰腺癌细胞MiaPaCa-2的侵袭能力及EMT指标E-cadherin、Vimentin的变化。结果 CXCL12/CXCR4/CXCR7生物轴能够调控胰腺癌细胞的侵袭转移。CXCL12能显著增强胰腺癌细胞的侵袭转移能力,与单独沉默CXCR4或CXCR7相比,同时抑制CXCR4和CXCR7可以显著抑制CXCL12的促胰腺癌细胞侵袭转移作用。结论 CXCL12/CXCR4/CXCR7生物轴能够调控胰腺癌细胞侵袭转移及EMT发生。     

下调尾型同源盒基因-2对结肠癌细胞的侵袭及迁移能力的影响及其机制

目的观察下调尾型同源盒基因-2(CDX2)对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响,并初步探讨CDX2基因在结肠癌发生发展过程中的作用及机制。方法构建CDX2RNAi慢病毒载体,并转染人结肠癌SW480、HT29细胞,应用Western blotting及qRT-PCR技术检测CDX2基因的干扰效率;应用Transwell及划痕实验检测下调CDX2表达对SW480、HT29细胞侵袭、迁移能力的影响;Western blotting及RT-PCR检测下调CDX2表达对SW480、HT29细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基因(E-cadherin、ZEB-1、Vimentin、Twist、Snail)表达的影响。结果构建的CDX2RNAi慢病毒载体可有效地抑制SW480、HT29细胞中CDX2基因的表达;转染LV-CDX2-shRNA组与转染空病毒组(LV-NT-shRNA)及空白对照组相比,侵袭、迁移能力显著增强(P<0.05);且E-cadherin表达下降,ZEB-1、Vimentin、Twist、Snail表达均升高。结论下调CDX2可诱导EMT发生,从而增强结肠癌细胞的侵袭迁移能力。     

大骨节病差异表达基因PAPSS2对成骨细胞矿化及碱性磷酸酶活性的影响

目的探讨大骨节病差异表达基因PAPSS2在MC3T3-E1细胞成骨样分化过程中的表达及其对碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞矿化的影响。方法培养MC3T3-E1细胞并诱导成骨分化,观察PAPSS2在成骨细胞分化过程中的基因及蛋白表达情况;用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术或逆转录病毒转染高表达载体,分别构建PAPSS2低表达慢病毒及逆转录病毒高表达载体包装,滴度测定,验证细胞转染效率;分别转染MC3T3-E1细胞并设空白对照组,观察PAPSS2沉默或高表达后ALP活性的变化及细胞成骨矿化的影响。结果 PAPSS2在成骨细胞分化过程中mRNA及蛋白均随着矿化过程表达增加。用慢病毒介导的RNAi技术,成功降低了MC3T3-E1成骨细胞中PAPSS2的表达,使用逆转录病毒转染高表达载体显著增加PAPSS2基因的表达。PAPSS2沉默表达时,ALP活性和细胞矿化作用显著降低,高表达后其作用相反。结论 PAPSS2可调节成骨细胞ALP活性和细胞矿化作用,其异常表达可能与大骨节病骨骼病变相关。     

CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF EUKARYOTIC VECTOR EXPRESSING SIRNA SPECIFIC FOR BACE

TheAlzheimer sdisease(AD)isaseriousde generativediseaseandmanifestedthedepositionof amyloid peptide(Aβ)intosenileplaquesintheex tracellularspaceandthehyperphosphorylationoftau proteincausingneurofibrillarytangles[1].RNAinterference(RNAi)isanancientevolu …     

CONSTRUCTION OF ACTIVE RECOMBINANT CASPASE-3 EUKARYOTIC EXPRESSION PLA SMID AND EFFECT OF r-CASPASE-3 ON APOPTOSIS OF PANCREATIC CARCINOMA CELLS

Ａｓｅｒｉｅｓｏｆｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ(ｃａｓｐａｓｅ)ｔｈａｔｐｌａｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｈａｖｅｂｅｅｎｃｌｏｎｅｄ .Ｃａｓｐａｓｅ 3(ＣＰＰ32 /Ｙａ ｍａ/ａｐｏｐａｉｎ)ｈａｓｂｅｅｎｔｈｏｕｇｈｔｔｏｂｅｔｈｅｋｅｙｐｒｏｔｅａｓｅａｍｏｎｇｃａｓｐａｓｅｆａｍｉｌｙ .Ａｃｔｉｖｅｃａｓｐａｓｅ 3ｃａｎａｆｆｅｃｔｔｈｅｏｔｈｅｒｍｅｍｂｅｒｓｏｆｃａｓｐａｓｅｓｆａｍｉｌｙ ,ｍｏｒｅｏｖｅｒ…     

siRNA AGAINST SURVIVIN SUPPRESSES THE PROLIFERATION OF PANCREATIC CANCER CELL PC-2 AND INDUCES ITS APOPTOSIS

Survivinis a member of the inhibitor of apop-tosis family,whichinhibits cell apoptosis and regu-lates cell division.Survivin is expressed in embry-onic tissues as well as in the majority of humancancers,but is not expressed in most nor mal adulttissues.The highly cancer-specific expression ofSurvivin,coupled withits i mportance in inhibitingcell apoptosis and in regulating cell division,makesit a useful diagnostic marker and ideal target forcancer treat ment[1].RNAi is a process of post trans…     

VEGF-C、CXCR4在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及意义

目的分析血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、趋化因子受体-4(CXCR4)在乳腺浸润性导管癌组织及乳腺纤维腺瘤组织中的表达,探讨其与淋巴管生成、乳腺癌的淋巴转移的关系。方法应用免疫组织化学方法检测72例乳腺癌组织、15例乳腺纤维腺瘤中VEGF-C、CXCR4的表达。结果 72例乳腺癌组织中VEGF-C、CXCR4的表达率分别为76.4%、58.3%,显著高于乳腺纤维腺瘤组织(20%、13.3%),差异有统计学意义(P<0.01)。VEGF-C、CXCR4的表达与患者的年龄、肿瘤大小、雌孕激素受体(ER、PR)的表达无关(P>0.05),而与组织学分级、临床分期、淋巴管的浸润及淋巴结转移有关(P<0.01)。结论 VEGF-C、CXCR4在介导乳腺癌细胞淋巴管浸润及淋巴结转移中可能起重要协同作用。     

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础     

外源性p16基因对肾癌细胞周期及体外增殖的影响

目的　观察外源性 p16基因对肾癌细胞周期的影响及其对肾癌细胞的生长抑制作用。方法　利用携带人 p16基因的真核表达载体,采用脂质体介导法将其导入人肾癌细胞系 GRC- 1 中,观察其对瘤细胞的作用。结果　①免疫组织化学方法检测显示转染 p16基因的GRC 1细胞可显著表达 p16蛋白。②流式细胞仪检测证明,外源性 p16 基因可在肾癌细胞周期G1期到S期发挥抑制作用。③与对照组相比,转染 p16 基因的 GRC- 1 细胞生长明显受到抑制。结论　外源性 p16基因具有细胞周期特异性地抑制肾癌细胞生长的作用。     

环氧合酶-2在食管癌、胃癌、贲门癌的表达比较

目的　研究环氧合酶2(Cox 2)蛋白及其mRNA在食管癌、胃癌、贲门癌中的表达量和细胞内定位的异同,探讨Cox 2抑制剂对贲门癌的预防作用。方法　免疫组化法定量检测了3 种肿瘤共48 例标本的Cox 2 蛋白,RT PCR法和原位PCR法检测了其中29 例标本的Cox 2mRNA及其在组织细胞内的定位。结果　食管癌、胃癌、贲门癌的Cox 2染色分数分别为4.15±1.39, 3.66±1.16, 2.93±1.03,均高于正常组织。贲门癌的染色分数与胃癌的无显著性差异。Cox 2mRNA在贲门癌的检出率为87.5%(ISPCR),75%(RT PCR),在胃癌、食管癌的检出率为100%,无显著性差异。Cox 2mRNA位于癌细胞胞浆,胞核中也有少量存在,其在3 种肿瘤中相同。结论　Cox 2 在贲门癌中显著升高,其表达特点与胃癌、食管癌中基本相同。Cox 2抑制剂对贲门癌可能有预防作用。     

结肠癌患者外周血DcR3与CEA联合测定的临床价值

目的联合检测结肠癌患者外周血中DcR3与癌胚抗原(CEA)mRNA的水平,建立取材于外周血的早期诊断结肠癌的新方法。方法44例结肠癌患者和30名健康志愿者,各取5 mL静脉血,肝素抗凝,密度梯度离心法分离外周血单核细胞,细胞总RNA TRIzol提取液提取外周血单核细胞总RNA,用半定量RT PCR法检测外周血单核细胞中DcR3与CEA mRNA的水平,并用t检验进行比较。结果结肠癌患者外周血中DcR3基因的相对表达水平为0.415±0.078,与健康对照组(0.235±0.074)比较有显著性差异(P<0.05),但患者之间没有明显差异(P>0.05)。CEA在结肠癌患者外周血中阳性率为36.4%(16/44),表达水平为0.346±0.071。30名健康志愿者均为阴性。结论DcR3基因在结肠癌患者外周血中表达水平明显高于健康人,其表达水平与结肠癌有相关性。在CEA阴性情况下,DcR3可能成为新的肿瘤标志物。