靶向下调Cep55表达水平对肝癌细胞增殖能力的影响

目的通过siRNA干扰技术下调中心体相关蛋白Cep55的表达水平,并检测对肝癌HepG2和Hep3B细胞增殖能力的影响,为原发性肝癌的基因靶向治疗提供理论依据。方法应用Cep55特异性siRNA转染肝癌HepG2和Hep3B细胞,采用Real-time PCR和Western blot方法分别从mRNA和蛋白质水平检测Cep55siRNA对Cep55基因的干扰效果,MTT法检测下调Cep55表达水平时细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测细胞周期分布变化。结果与阴性对照组比较,干扰siRNA组Cep55的mRNA及蛋白表达水平均出现明显降低(P<0.05);MTT检测结果显示下调Cep55表达水平能够显著抑制肝癌细胞增殖(P<0.05);流式细胞仪检测显示下调Cep55表达水平能够增加G1期细胞的比例,同时降低G2-M期细胞的比例,出现明显的G2期阻滞。结论下调Cep55表达水平能够显著抑制肝癌细胞的增殖能力,并出现G2期阻滞,提示Cep55可能成为原发性肝癌的有效治疗靶点。     

外源性p16基因对肾癌细胞周期及体外增殖的影响

目的　观察外源性 p16基因对肾癌细胞周期的影响及其对肾癌细胞的生长抑制作用。方法　利用携带人 p16基因的真核表达载体,采用脂质体介导法将其导入人肾癌细胞系 GRC- 1 中,观察其对瘤细胞的作用。结果　①免疫组织化学方法检测显示转染 p16基因的GRC 1细胞可显著表达 p16蛋白。②流式细胞仪检测证明,外源性 p16 基因可在肾癌细胞周期G1期到S期发挥抑制作用。③与对照组相比,转染 p16 基因的 GRC- 1 细胞生长明显受到抑制。结论　外源性 p16基因具有细胞周期特异性地抑制肾癌细胞生长的作用。     

hTERT转染永生化新生大鼠耳蜗基底膜细胞的研究

目的通过基因转染法获得新生大鼠耳蜗基底膜细胞永生化细胞系。方法通过脂质体法将pCI-neo-hTERT质粒转染原代培养的新生大鼠耳蜗基底膜细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞系,并行转染细胞RT-PCR、端粒酶活性、细胞周期、细胞凋亡等检测。结果转染72h后RT-PCR检测到人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因阳性表达,转染细胞通过G418筛选传代后,可检测到端粒酶活性,流式细胞术检测提示转染细胞增殖活力增强不明显,但细胞凋亡明显减少。结论通过脂质体转染hTERT基因,可使新生大鼠耳蜗基底膜细胞凋亡减少,传代能力增强,给耳蜗细胞实验提供足够的细胞来源。     

新基因Clorf63功能的初步研究

目的 检测Clorf63基因在肝癌和癌旁组织中的定位,以及Clorf63在多种人肝癌细胞系和人胃癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平;检测干涉Clorf63后对人胃癌细胞MKN28的细胞周期的影响.方法 免疫组化染色法检测Clorf63基因在组织中的定位;Real-time PCR和Western blot分别检测Clorf63基因在细胞中的表达;脂质体转染法将干涉片段转染至MKN28细胞中,Real-time PCR和Western blot法筛选有效干涉片段;流式细胞术检测Clorf63干涉后对MKN28细胞的细胞周期的影响.结果 Clorf63在肝癌和癌旁组织细胞中都有胞浆表达,在MKN28细胞中表达量较高,在MKN45细胞中表达量较低;成功筛选出Clorf63基因的有效干涉片段;Clorf63干涉后,胃癌细胞MKN28发生G1期阻滞,经统计学分析,Clorf63干涉后MKN28细胞增殖指数降低(P＜0.05).结论 Clorf63在人肝癌和癌旁组织细胞胞浆中都有表达,在MKN28细胞中表达量最高;干涉Clorf63基因后,可使MKN28细胞发生G1期阻滞,为该基因功能的后续研究奠定了基础.     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因表达对人肝癌细胞的生长抑制

使用转导有单纯疱疹Ⅰ型病毒胸苷激酶（ＨＳＶ１－ＴＫ）基因的人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞株建立了裸鼠移植瘤模型，并进行了在体和体外试验性无环鸟苷（ＡＣＶ）治疗。结果发现基因转导后的肝癌细胞表现出对ＡＣＶ的敏感性，肝癌细胞生长抑制与ＡＣＶ的剂量有关；用药组裸鼠除平均瘤重明显低于对照组外，还可见细胞核分裂指数降低，伴有细胞变性和坏死。结果表明：ＨＳＶ１－ＴＫ基因经逆转录病毒转导后，用ＡＣＶ诱导表达明显抑制了人肝癌细胞的生长。     

新基因C1orf63功能的初步研究

目的检测C1orf63基因在肝癌和癌旁组织中的定位,以及C1orf63在多种人肝癌细胞系和人胃癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平;检测干涉C1orf63后对人胃癌细胞MKN28的细胞周期的影响。方法免疫组化染色法检测C1orf63基因在组织中的定位;Real-time PCR和Western blot分别检测C1orf63基因在细胞中的表达;脂质体转染法将干涉片段转染至MKN28细胞中,Real-time PCR和Western blot法筛选有效干涉片段;流式细胞术检测C1orf63干涉后对MKN28细胞的细胞周期的影响。结果 C1orf63在肝癌和癌旁组织细胞中都有胞浆表达,在MKN28细胞中表达量较高,在MKN45细胞中表达量较低;成功筛选出C1orf63基因的有效干涉片段;C1orf63干涉后,胃癌细胞MKN28发生G1期阻滞,经统计学分析,C1orf63干涉后MKN28细胞增殖指数降低(P<0.05)。结论 C1orf63在人肝癌和癌旁组织细胞胞浆中都有表达,在MKN28细胞中表达量最高;干涉C1orf63基因后,可使MKN28细胞发生G1期阻滞,为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

miR-3691-5p靶向抑制TET1表达促进肝癌细胞迁移与侵袭

目的探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中miR-3691-5p的表达、临床意义及作用机制。方法实时定量PCR(qPCR)检测miR-3691-5p在HCC组织与癌旁组织、正常肝细胞(L02)与HCC细胞系中的表达;TCGA数据库分析正常肝组织及肝癌组织中miR-3691-5p的表达差异,分析miR-3691-5p的表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系;在MHCC97-H细胞中敲减miR-3691-5p,Transwell实验评价细胞侵袭及迁移能力;TargetScan数据库预测下游靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验加以验证。结果与癌旁组织和正常肝细胞相比,miR-3691-5p在HCC组织及细胞系中均呈现高表达(P<0.05),并与门静脉侵犯(P=0.006)、TNM分期(P=0.008)及Edmondson分级(P=0.001)有关;基于TCGA数据库数据的生存分析显示,miR-3691-5p高表达与不良预后相关(P=0.016);在MHCC97-H细胞中敲减miR-3691-5p抑制细胞的侵袭及迁移;通过生物信息学预测并通过双荧光素酶报告基因实验证实,TET1(Ten-Eleven Translocation 1)是miR-3691-5p的直接靶基因,回复实验证实TET1介导了miR-3691-5p对肝癌细胞侵袭及迁移能力的促进作用。结论 miR-3691-5p在HCC中通过靶向抑制抑癌基因TET1促进肝癌细胞侵袭及迁移。     

DNMT3B基因在肝细胞癌中的表达及其对肝癌细胞增殖和侵袭迁移的影响

目的探讨DNA甲基转移酶3b(DNMT3B)基因在肝细胞癌(HCC)组织中的表达及其对肝癌细胞增殖、侵袭迁移的影响及机制。方法收集46例肝癌患者的癌组织与对应癌旁组织,qRT-PCR法检测DNMT3B在肝癌组织及对应癌旁组织中的表达,并分析其与临床病理特征之间的关系;应用RNA干扰(RNAi)技术合成针对DNMT3B的siRNA并转染MHCC97-H细胞,qRT-PCR和Western blot检测相关基因mRNA和蛋白表达;MTT法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力。结果 46例肝癌患者中,DNMT3B基因在肝癌组织中的表达较对应癌旁组织升高者占73.91%,其高表达与肝癌的病理分化类型和肿瘤大小有关(P均<0.05);在细胞水平,抑制DNMT3B基因表达使MHCC97-H细胞增殖及侵袭迁移能力降低;干扰DNMT3B基因可以增加抑癌相关基因RASSFA1、APC、MTSS1mRNA和蛋白表达水平。结论 DNMT3B与肝癌的进展密切相关,它可能通过调控下游抑癌基因甲基化水平影响其表达,从而抑制肝癌细胞的增殖及侵袭迁移能力。     

舒芬太尼抑制肝癌Hep3B细胞活性及促进凋亡作用

目的探讨舒芬太尼对肝癌Hep3B细胞活性的影响及相关机制。方法以Hep3B肝癌细胞为研究对象,经不同浓度(0.01、0.1、1、5、10、15μmol/L)舒芬太尼处理后,MTT法观察细胞活性的改变,流式细胞仪及AnnexinV/PI双标记染色检测Hep3B细胞周期及凋亡的变化,Western blot检测survivin及caspase-3蛋白的表达。结果随着舒芬太尼浓度的增加,肝癌细胞活性降低,细胞周期停滞在G0/G1期,细胞凋亡增多,survivin蛋白表达量降低,caspase-3蛋白表达量升高。结论舒芬太尼能通过改变肝癌细胞的细胞周期,促进细胞凋亡,改变survivin和caspase-3蛋白的表达,抑制Hep3B细胞的活性。     

长链非编码RNA SNHG5对肝癌上皮间质转化及肿瘤干细胞增殖的影响

目的探讨长链非编码RNA SNHG5在肝癌组织中的表达及对肝癌上皮间质转化(EMT)和肿瘤干细胞增殖的影响。方法收集48例患者的肝癌组织与对应癌旁组织,qRT-PCR检测SNHG5在肝癌组织及对应癌旁组织中的表达,分析其与临床病理特征之间的关系;构建SNHG5敲除慢病毒,转染肝癌细胞系,qRT-PCR验证敲除效率;Transwell实验检测细胞侵袭迁移能力的变化,干细胞瘤球形成实验检测肝癌干细胞的形成与增殖能力;qRT-PCR和Western blot检测EMT与干细胞调控相关基因mRNA和蛋白水平的表达。结果 48例肝癌患者中,SNHG5在肝癌组织中的表达较对应癌旁组织明显升高,其高表达与肝癌的肿瘤大小、HBV感染、病理分化类型和临床分期有关(P<0.05)。在细胞水平,敲除SNHG5能抑制肝癌细胞HepG2和Huh7的侵袭迁移能力和干细胞球数量及直径;同时SNHG5敲除组E-cadherin表达明显增高,而N-cadherin和干细胞调控基因OCT4、SOX2表达均明显降低(P<0.05)。结论 SNHG5在肝癌中高表达,敲除SNHG5抑制肝癌细胞的侵袭迁移与肿瘤干细胞的增殖,其机制可能与敲除SNHG5促进肝癌细胞系EMT的逆转、降低肝癌干细胞特性获得有关。     

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础     

增强型绿色荧光蛋白标记的Hela细胞株的建立

目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。     

抗人CD3单链抗体四聚体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　将抗人CD3单链抗体 (scFv) /人 p5 3四聚功能域融合基因转染到HeLa细胞 ,进行真核表达和活性测定。方法　将抗人CD3scFv /人 p5 3四聚功能域融合基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Westernblot证实 ,为Mr约35 0 0 0的特异蛋白条带。纯化后经流式细胞仪检测 ,可特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMCs) ,亲和力高于scFv。结论　获得了可与PBMCs特异性结合的抗人CD3scFv四聚体 ,为进一步临床应用奠定了基础     

Eukaryotic expression and biological activity analysis of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin

Objective To investigate the expression of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin (HNG) in eukaryotic cells by gene engineering technique and analyze its biological activity. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of HNG with FLAG in its C-terminal was obtained, which was cloned into the plasmid pcDNA3.1(-), and the resultant recombinant vector pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was transfected into PC12 cells. At the same time, the recombinant vector pcDNA3.1(-)/EGFP was transfected to control the efficiency of transfection. The expression of HNG in the cells was determined by immunocytochemistry. In order to analyze the biological activity of the expressed HNG, 25μM Aβ25-35 peptide was added to the culture medium of the transfected cells for 24h, then cell morphology, MTT assay and Hoechst 33258 staining were observed. Results The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was identified by enzyme digestion and sequencing. HNG was highly expressed in PC12 cells. After exposure of PC12 cells to 25μM Aβ25-35 for 24h, cell viability decreased to (65.8±5.3)%, and the dystrophic changes of neuritis and nuclei condensation were obvious. When cells were pre-transfected with pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG, Aβ25-35-induced cell death and morphological changes of cells and nuclei were suppressed. In contrast, pre-transfected with empty vector did not protect cells from Aβ25-35-induced toxicity. Conclusion The eukaryotic expression vector for FLAG-tagged HNG was successfully constructed and expressed in PC12 cells. Expressed HNG has biological activity.     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

人颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡

目的　观察诱导表达的颗粒酶B融合蛋白对HeLa细胞形态和生长的作用。方法　用重组PCR法将活性型颗粒酶B基因序列的 5’端连接绿脓杆菌外毒素 (PE)的部分转位肽编码序列。所获融合蛋白基因克隆入pIND诱导表达载体后 ,与辅助质粒pVgRXR共转染HeLa细胞 ,经G4 18和zeocin筛选建系。间接免疫荧光检测蜕皮激素诱导后目的蛋白的表达 ,并通过电镜、TUNEL染色、细胞计数等方法观察细胞的形态和生长速度的变化。结果　建立了可诱导表达人颗粒酶B融合蛋白基因的HeLa细胞系。蜕皮激素诱导后检测到目的蛋白的表达 ,同时观察到细胞出现多核巨细胞的异常形态 ,细胞生长受到抑制。电镜和TUNEL分析表明 ,颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达使部分细胞呈现凋亡的典型特征。结论　颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡     

尾型同源盒基因-2过表达对结肠癌细胞生物学性状的影响

目的观察尾型同源盒基因-2(CDX2)对结肠癌细胞生物学性状的影响,探讨CDX2基因在结肠癌发生发展中的作用。方法克隆人结肠CDX2基因,构建含CDX2的pEGFP-C1-CDX2表达载体,同时设pEGFP-C1空载体组及空白对照组。利用脂质体法将pEGFP-C1-CDX2和pEGFP-C1质粒分别转染Lovo细胞,应用Western blotting技术检测Lovo细胞中CDX2基因的表达;应用MTT法及流式细胞仪检测CDX2对Lovo细胞增殖、凋亡及周期的影响;应用ELISA法检测CDX2过表达对Lovo细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。结果成功构建含CDX2真核表达载体。瞬时转染pEGFP-C1-CDX2的Lovo细胞48 h有较高水平的CDX2蛋白的表达;与pEGFP-C1空载体组及空白对照组比较,转染pEGFP-C1-CDX2组的Lovo细胞在转染72 h时生长未见明显抑制,G1期及S期所占比例无明显改变,凋亡率亦无明显增加(P均>0.05),但MMP-2分泌明显减少(P<0.05)。结论 CDX2过表达对Lovo细胞增殖、凋亡及周期无明显影响,但能够明显减弱Lovo细胞的侵袭力,从而对结肠癌浸润转移起抑制作用。     

短发卡RNA抑制survivin表达并诱导CNE-2细胞凋亡

目的观察以短发卡RNA(shRNA)抑制鼻咽癌细胞survivin表达对细胞凋亡与增殖的影响。方法构建特异性survivin shRNA,转染CNE-2细胞。分组:A组为空白对照组;B组为阴性干扰组,转染pSIREN-survivin/nonsenseshRNA;C组为阳性干扰24h组,转染pSIREN-survivin/shRNA;D组为阳性干扰48h组,转染pSIREN-survivin/shRNA。以RT-PCR、Western-blot分别测定细胞survivin mRNA及蛋白,PI、TUNEL及MTT检测细胞周期、凋亡率、细胞增殖。结果转染效率约(70.90±4.76)%;C组survivin mRNA和蛋白抑制率分别为(41.58±0.63)%、(68.29±0.52)%;D组抑制率分别为(63.64±0.96)%、(70.83±0.48)%。C组凋亡率为(36.24±0.78)%,D组为(50.37±0.85)%,显著高于B组和A组;S期细胞减少,G2/M期比例增高;MTT结果提示细胞增殖受到明显抑制。结论特异性shRNA可有效干扰CNE-2内survivin的表达,诱导细胞凋亡并抑制其过度增殖。     

重组小鼠血管抑素基因在胆囊癌细胞中的表达及对血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的　研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞能否表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白。方法　应用脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC SD ,G4 18抗性筛选 ;以Westernblot检测血管抑素的表达 ,以血管内皮细胞增殖分析检测其活性。结果　经Westernblot检测 ,得到高表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆 ,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖 (P <0 .0 5 )。结论　小鼠血管抑素基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转导的胆囊癌细胞能够表达具有生物学活性的血管抑素蛋白 ,在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值     

siRNA沉默MAPK p42对肝癌SMMC7721增殖和凋亡的影响

目的应用siRNA沉默SMMC7721细胞MAPK p42,并观察其对增殖和凋亡的影响。方法应用SilencerTMsiRNA构建试剂盒合成2条MAPK p42siRNAs和一条随机对照siRNAs,用脂质体LipofectaminTM 2000将其转染入肝癌SMMC-7721细胞株。应用Western blot检测MAPK p42表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期及其细胞凋亡。结果与对照相比,MAPK p42siRNA明显抑制MAPK p42表达。MAPK p42siRNA抑制了SMMC-7721细胞的生长,将细胞阻滞于细胞周期S期,进而诱导了细胞凋亡的发生。结论 MAPK p42靶向siRNA可能为肝癌基因治疗的重要手段。