表达US3基因腺病毒载体下调CTL和NK细胞对其转染肝细胞杀伤活性的影响

目的研究表达US3基因重组腺病毒载体对其转染肝细胞介导的免疫逃逸活性。方法首先构建表达US3基因腺病毒载体,扩增纯化后转染HL-7702肝细胞,利用细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验和自然杀伤细胞(NK)杀伤实验,检测表达US3基因重组腺病毒载体的免疫活性。结果表达US3基因的重组腺病毒r-US3成功构建,r-US3能够明显降低CTL和NK细胞对转染肝细胞的杀伤活性。结论表达US3基因腺病毒载体在一定程度上能够介导转染肝细胞的免疫逃逸,降低机体免疫系统对转染肝细胞的排斥反应。     

白细胞介素-2协同白细胞介素-18活化自然杀伤细胞活性的作用

目的研究白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-18(IL-18)诱导自然杀伤(NK)细胞活化和抗骨髓瘤细胞活性的协同作用。方法流式细胞仪方法检测NK细胞表面CD69的表达;阴性细胞纯化法用于获得高纯度的NK细胞;ELISA测定NK细胞培养上清液中干扰素(IFN-γ)的浓度;标准铬51释放试验评估NK细胞杀伤骨髓瘤细胞的能力。结果与单一应用IL-18相比,低浓度IL-2和IL-18联合应用显著提高了NK细胞的活性、分泌干扰素(IFN-γ)的水平和杀伤骨髓瘤细胞的作用。结论低浓度IL-2具有协同IL-18活化NK细胞抗骨髓瘤细胞的作用,此结果为IL-2和IL-18联合应用治疗骨髓瘤奠定了一定的理论基础。     

aptamer-siRNA核酸复合物对K562细胞凋亡的促进作用

目的观察aptamer-siRNA核酸复合物对人慢性粒细胞白血病(CML)细胞株K562细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法使用不同浓度的aptamer-siRNA溶液转染K562细胞,噻唑蓝(MTT)法检测aptamer-siRNA对K562细胞增殖的影响,AnnexinV/PI双染法检测aptamer-siRNA对K562细胞凋亡的影响,Western blot和RT-PCR法检测aptamer-siRNA对K562细胞bcl-2、Bax和caspase-3蛋白及mRNA表达的影响。结果与对照组相比,转染aptamer-siRNA后K562细胞增殖受到明显抑制,K562细胞的早期凋亡率明显增加,细胞中bcl-2蛋白和mRNA的表达水平明显降低,Bax和caspase-3蛋白和mRNA的表达水平明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。aptamersiRNA核酸复合物浓度(50~250μmol/L)对bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA的影响具有明显的量效关系。结论aptamer-siRNA核酸复合物能够通过促使bcl-2基因减少和Bax、caspase-3基因增长,进而促进K562细胞凋亡。     

Caspase-3和Bcl-2在白血病细胞株凋亡过程中的表达及其与多药耐药的关系

目的研究Caspase-3在阿霉素(ADR)诱导的K562和K562/AO2细胞株凋亡过程中对Bcl-2蛋白表达的调控,探讨两者相互作用在白血病多药耐药中的分子机制。方法原位细胞凋亡检测法观察凋亡细胞的形态学改变;流式细胞仪测定凋亡率及Bcl-2蛋白的表达;酶显色活性分析法测定Caspase-3的活性。结果①K562细胞株的凋亡率对ADR呈时间、剂量依赖关系,K562/AO2细胞株则无此依赖关系。②未加Caspase-3抑制剂的K562细胞株Bcl-2阳性表达率和Caspase-3活性对ADR呈时间、剂量依赖关系;加入抑制剂的则无此关系,但作用48 h后Bcl-2阳性表达率下降,Caspase-3活性上升。无论加入Caspase-3抑制剂与否,K562/AO2细胞株的Caspase-3活性和Bcl-2阳性表达率均无变化。结论Caspase-3的变化能引起Bcl-2蛋白表达水平的变化,二者与凋亡关系密切,并在多药耐药中发挥重要作用。     

重组人纤维连接蛋白对无血清培养的CIK细胞增殖及对K562细胞杀伤活性的影响

目的探讨重组人纤维连接蛋白(RetroNectin,RN)诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK增殖、免疫特性及对人类K562细胞杀伤活性的影响。方法密度梯度分离法分离外周血单个核细胞后分成两组,应用CD3单抗、IFN-γ、IL-2培养CIK细胞,一组含RN(RN组),一组不含RN(Non-RN组)。记录两组细胞增殖速度;用流式细胞术动态测定免疫细胞表型;用CBA细胞因子试剂盒检测IFN-γ、TNF-α及IL-4的分泌;用CFSE/PI双标法测定CIK细胞对人红白血病细胞株(K562)的体外杀伤活性。结果 RN组细胞生长明显快于Non-RN组(P<0.05);CD3+CD8+的细胞随着时间的延长逐渐增多,但两组间比较无统计学差异;CD3+CD56+细胞所占百分比在第5天和第10天时两组间比较均无统计学差异(P>0.05),在第15天时RN组有大幅度升高,第15、20、25天两组比较均有统计学差异(P<0.05)。细胞毒杀伤活性结果显示,RN组与Non-RN组对K562细胞毒活性亦有统计学差异。两组间细胞因子IFN-γ、TNF-α随着培养时间的延长,分泌量逐渐升高。结论使用RN诱导的CIK细胞增殖速度快,杀伤肿瘤细胞活性高,是一种安全高效的细胞培养方法。     

K562/A02细胞株核因子-κB活性与P糖蛋白的表达

目的探讨K562/A02细胞株NF-κB活性与P-gp表达的关系。方法在K562/A02白血病耐药细胞株培养中加入NF-κB抑制剂PDTC,观察在不同浓度、不同时间下,细胞株NF-κB活性的变化与P-gp表达的关系。结果在不同浓度、不同时间的PDTC作用下,K562/A02细胞株NF-κB活性与P-gp表达呈正相关的关系,随干预浓度、时间的不断变化,二者均逐渐下降。结论NF-κB调控的白血病细胞抗凋亡机制中有MDR1的参与。     

绞股蓝总皂甙对小鼠S_(180)肉瘤及K_(562)细胞的抑制作用

目的　绞股蓝总皂甙 (GP)对小鼠S180 肉瘤及K562 细胞的抑制作用。方法　通过动物实验观察绞股蓝总皂甙对小鼠S180 肉瘤生长状况、肿瘤坏死面积 (TNA)与肿瘤总面积 (TTA)的比率、瘤周瘤内免疫活性细胞浸润状况及荷瘤小鼠脾脏的影响 ;通过细胞培养观察绞股蓝总皂甙对K562 细胞生长的抑制作用。结果　经重复实验证实 ,GP能显著抑制小鼠S180 肉瘤的生长 ,TNA与TTA的比率显著增加 ,瘤周尤其是瘤内淋巴细胞、巨噬细胞浸润数量明显增加 ,荷瘤小鼠脾重增加、脾白髓数目增多、体积增大。同时证实 ,GP对K562 细胞株具有明显的生长抑制作用。结论　GP的抑瘤作用主要是直接杀伤瘤细胞 ,免疫活性细胞也发挥了一定作用     

Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达

目的　构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法　采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础上构建真核表达载体pcDNA/anti CD3scFv B7.1,并经脂质体法转染COS 7细胞 ,免疫组织化学法检测表达。结果　获得了序列与预期完全相同的融合基因 ;构建了抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ;在COS 7细胞中获得初步表达。结论　成功构建及表达抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ,为进一步研究抗CD3scFv B7.1双功能分子的生物学活性及用于肿瘤生物治疗奠定了基础     

血管内皮生长因子反义核酸增强华蟾素诱导K562细胞凋亡

目的 研究VEGF反义核酸(ASON)增强华蟾素对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应.方法 合成VEGF ASON转染入K562细胞,4种浓度的华蟾素(1、3、5、7mg/L)作用于K562细胞株24、48、72h,应用Western blot法检测VEGF蛋白的表达,原位细胞凋亡(TUNEL)、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡.结果 不同剂量华蟾素组对K562细胞株均有抑制作用,并具有时间和浓度依赖性.经VEGF ASON转染的K562细胞株对华蟾素的诱导凋亡作用更加明显.结论 华蟾素在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,VEGF ASON可增强华蟾素诱导K562细胞凋亡的作用.     

B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性

目的　真核表达B7.1细胞外编码区以研究其生物学活性。方法　电穿孔法将重组质粒pDisplay/B7.1(V +C)导入人子宫颈癌细胞株 ,免疫组化及核酸原位杂交法分别检测其蛋白及mRNA表达 ,3 H TdR掺入法测定表达物对T细胞的刺激作用 ;MTT法研究转染细胞 T细胞混合培养引发的细胞毒性杀伤作用。结果　B7.1细胞外区在Hela细胞表面表达 ,所表达的B7.1细胞外区在抗CD3单抗存在的情况下具有刺激T细胞活化的特性 ,重组质粒转染的Hela细胞与T细胞混合培养可引起细胞毒性杀伤。结论　真核表达的B7.1(V +C)具有T细胞共刺激活性 ,可用于构建肿瘤免疫治疗之双功能分子。     

肺癌患者外周血T细胞亚群及免疫细胞活性的研究

采用 APAAP法和流式细胞仪研究 32例肺癌患者及 30例健康人外周血T细胞亚群及免疫细胞活性 ( NK- A)的变化。结果表明 :肺癌患者外周血 CD+3 、CD+4、CD+4/CD+8及 NK- A与正常人比较呈显著性降低 ( P <0 .0 5 ,P <0 .0 1 ) ;且肺癌伴癌转移者与未转移者上述各项指标亦有显著性差异 ( P <0 .0 5 )。说明肺癌患者存在细胞免疫功能降低 ;伴有癌转移的肺癌患者细胞免疫功能更低。提出积极调节肺癌患者细胞免疫功能 ,增强机体抗肿瘤能力十分重要。     

Graves’病样自然杀伤T细胞缺如小鼠血清TSH受体抗体的水平

目的　探讨自然杀伤T细胞 (naturalkillerTcell,NKT)在Graves’病发病中的作用。方法　用表达有人TSH受体的细胞免疫NKT细胞缺如小鼠和野生型BLAB/c小鼠 ,每两周一次 ,共 6次。在最后一次免疫结束后两周处死小鼠 ,检测血清甲状腺素水平 ,TSH受体抗体。结果　免疫后的NKT细胞缺如小鼠 ,血清TT4和TRAb水平轻度升高 ,并且与对照组比较 ,有显著性差异。但是 ,在经免疫的NKT细胞缺如小鼠和野生型小鼠之间 ,血清平均TT4水平和TRAb水平相似 ,且TSAb与TSBAb水平变化两组之间无显著性差异。结论　NKT细胞可能不参与Graves’病的发生     

普乐康对HIV/AIDS患者细胞免疫功能的影响

目的　探讨中药普乐康对HIV/AIDS患者细胞免疫功能的影响。方法　普乐康治疗前后 ,采用PHA体外诱导淋巴细胞增殖 ,观测治疗前后淋巴细胞增殖能力的变化 ,并测定血清细胞因子IL 2和IFN γ浓度的变化 ;用LDH释放法测定NK和LAK细胞的杀伤活性 ,对结果进行统计学处理。结果　用药后HIV/AIDS患者血液的淋巴细胞对PHA诱导的增殖能力、血清IL 2和IFN γ水平均明显高于治疗前 (P均 <0 .0 5 ) ;NK和LAK细胞的杀伤活性亦明显高于治疗前 (P <0 .0 5 )。结论　普乐康可以改善HIV/AIDS患者细胞免疫功能紊乱状态 ,有助于患者机体的康复。     

Study on T lymphocyte subsets and NK cells in patients with Graves＇ disease combined with type 2 diabetes

Objective To investigate changes in T lymphocyte subsets and NK cells in patients with simple Graves' disease (GD)and Graves' disease combined with type 2 diabetes mellitus (GD/T2DM). Methods Fifteen cases of GD/ T2DM were selected from our hospital from November 2001 to November 2004. Before and after therapy thyroid function, thyroglobulin antibody (TGA), thyroid microsomal antibody (TMA) and blood glucose level were measured, and T lymphocyte subsets (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) and NK cells (CD56) were measured by immunofluorescence double labeling monoclonal antibody and flow cytometry, respectively. At the same time, comparison was made with simple GD (15 cases), T2DM (15 cases) and healthy control (20 cases). Results Before therapy, CD4/CD8, CD4 and NK cells in GD/T2DM were less than normal, and there was no significant difference in comparison with simple GD (P<0.05). In T2DM group, only CD4/CD8 and CD4 were less than those of healthy controls (P<0.05). When thyroid function recovered after 1 to 3 months of methimazole treatment in both GD/T2DM and simple GD groups, various indexes recovered, which were more obvious in simple GD. Conclusion Immune hypofunction of GD may be the key to the immune abnormality of GD/T2DM, which is more significant than that of simple GD or T2DM. The recovery of thyroid function and immune abnormality is not consistent, and the recovery of GD is more significant than that of GD/T2DM.     

慢性溃疡性结肠炎患者外周血NK细胞活性的研究

作者等研究了慢性溃疡性结肠炎患者外周血NK细胞活性,与正常对照组比较明显降低(P<0.01)。在活动期和非活动期以及中医辨证分型中的大肠湿热型,脾虚挟湿型,NK细胞活性无差异。在服用类固醇治疗的病例中,NK细胞活性多显示降低。     

DC-CIK细胞的生物学活性及抗淋巴瘤细胞的作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后DC-CIK细胞的体外增殖能力、免疫表型变化、分泌细胞因子水平以及抗淋巴瘤细胞活性。方法正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、INF-γ的分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1-40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关。结论DC-CIK细胞的增殖能力、分泌细胞因子水平、抗淋巴瘤细胞活性均高于CIK细胞,为DC-CIK细胞免疫治疗提供了实验和理论依据。     

乙型肝炎病毒全X基因对HEK293细胞功能的影响

目的克隆并构建乙型肝炎病毒(HBV)全X基因表达载体,探讨HBV全X基因对HEK293细胞功能的影响,并比较HBV全X基因与X基因对细胞影响的差异。方法应用基因克隆的方法从慢性HBV感染者血清中获得HBV全X及X基因,构建带有HBV全X基因与X基因的真核表达载体以及带有绿色荧光基团GFP的重组质粒;细胞转染技术将其分别转入HEK293细胞,RT-PCR及Western-blot技术验证HBV全X基因及X基因在细胞内的表达;荧光显微镜下观察其在细胞内的定位情况;MTT法检测细胞增殖率的变化;Annexin V流式细胞分析技术检测其对细胞凋亡率的影响;TRAP实时荧光定量PCR法检测各组细胞端粒酶活性的变化。结果成功构建带有HBV全X基因的重组质粒且目的基因能在HEK293细胞内高表达;表达的HBV全X蛋白主要分布在胞核,而X蛋白在胞质、胞核均有分布;转染HBV全X和X基因后细胞增殖率分别为(0.826±0.002)%和(0.805±0.013)%,显著高于转染空质粒(0.691±0.035)%和未转染对照组(0.681±0.018)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染HBV全X和X基因后细胞凋亡率分别为(25.25±3.02)%及(21.34±2.16)%,显著高于转染空质粒(13.49±1.49)%及未转染细胞对照组(11.37±1.58)%,差异具有统计学意义(P<0.05);转染全X及X基因细胞的端粒酶活性亦显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);全X转染组细胞的增殖率、凋亡率及端粒酶活性均高于X转染组,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV全X基因具有促细胞增殖、凋亡以及影响细胞端粒酶活性的作用,其可能通过不同于HBV X基因的细胞内途径影响细胞的生物学功能,从而在HBV相关的原发性肝细胞癌发生发展中起作用。     

放射抗拒性鼻咽癌细胞系的建立及差异表达基因

目的 筛选同一来源放射敏感性不同鼻咽癌细胞基因差异表达,探讨鼻咽癌放射抗拒机理.方法 用X射线间歇多次照射鼻咽癌细胞株CNE-2建立放射抗拒性细胞CNE-2R,采用BioStarH-141s型基因芯片检测CNE-2与CNE-2R差异表达基因.结果 CNE-2和CNE-2R细胞有差异表达的基因308条,上调176个,下调132个.在差异表达的基因中,有76个位点出现6倍以上的差异,其中36个下调、40个上调,包括与DNA修复相关、细胞周期、凋亡、细胞骨架相关蛋白、细胞增殖、代谢、蛋白质合成、信号转导、免疫相关等方面相关的基因,基因分布变化较明显的主要是DNA修复相关基因、细胞骨架、细胞周期和凋亡相关基因.结论 CNE-2细胞反复照射后产生放射抗拒性细胞,在基因水平上发生了某些突变,通过调控其中相关基因,就有可能调控细胞的放射敏感性.     

外源磷脂酰乙醇胺诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

目的 磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)在细胞凋亡的早期由细胞膜内侧翻转到外侧,与磷脂酰丝氨酸共同成为细胞凋亡的早期信号,但是其在凋亡中的作用尚不清楚.本研究探讨了PE对HeLa细胞凋亡的影响.方法 实验以人宫颈癌HeLa细胞系为材料,分别设置了空白对照组、0.125、0.25、0.5和1 mmol/L PE处理组.以MTT检测细胞生长情况,PI-流式细胞仪法检测细胞周期,Annexin V-PI法检测细胞凋亡.结果 与对照组相比,PE各处理组对HeLa细胞生长的抑制作用呈剂量与时间依赖性,并诱导细胞凋亡发生,但不影响细胞周期.结论 PE通过诱导细胞凋亡而抑制HeLa细胞的生长.