脐血树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞协同抗急性白血病细胞效应及生物学活性研究

目的研究脐血树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤(DC-CIK)细胞的体外增殖、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对急性白血病细胞细胞毒作用的影响。方法采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1∶5的比例混合培养,以脐血CIK细胞或外周血DC-CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤白血病细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果脐血DC-CIK细胞的增殖能力显著高于脐血CIK细胞和外周血DC-CIK细胞(P均<0.05);脐血DC、CIK细胞共培养后,CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例较同条件下CIK细胞明显增多(P<0.05);混合培养3 d,脐血DC-CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α含量均比CIK细胞单纯培养的分泌量高(P<0.01或P<0.05);在2.5∶1～20∶1的效靶范围内,脐血DC-CIK细胞对各亚型急性白血病细胞的杀伤率明显高于CIK细胞(P<0.05),且对各亚型白血病细胞杀伤活性无统计学意义,与外周血DC-CIK细胞对白血病杀伤效应相类同。结论脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗白血病效应。脐血DC-CIK细胞增殖能力比外周血DC-CIK细胞强,但两者在细胞毒方面无显著性差异。脐血来源丰富,且输注不易引起严重的移植物排斥反应,其DC-CIK细胞在免疫治疗方面应有更广泛的临床应用前景。     

重组人纤维连接蛋白对无血清培养的CIK细胞增殖及对K562细胞杀伤活性的影响

目的探讨重组人纤维连接蛋白(RetroNectin,RN)诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK增殖、免疫特性及对人类K562细胞杀伤活性的影响。方法密度梯度分离法分离外周血单个核细胞后分成两组,应用CD3单抗、IFN-γ、IL-2培养CIK细胞,一组含RN(RN组),一组不含RN(Non-RN组)。记录两组细胞增殖速度;用流式细胞术动态测定免疫细胞表型;用CBA细胞因子试剂盒检测IFN-γ、TNF-α及IL-4的分泌;用CFSE/PI双标法测定CIK细胞对人红白血病细胞株(K562)的体外杀伤活性。结果 RN组细胞生长明显快于Non-RN组(P<0.05);CD3+CD8+的细胞随着时间的延长逐渐增多,但两组间比较无统计学差异;CD3+CD56+细胞所占百分比在第5天和第10天时两组间比较均无统计学差异(P>0.05),在第15天时RN组有大幅度升高,第15、20、25天两组比较均有统计学差异(P<0.05)。细胞毒杀伤活性结果显示,RN组与Non-RN组对K562细胞毒活性亦有统计学差异。两组间细胞因子IFN-γ、TNF-α随着培养时间的延长,分泌量逐渐升高。结论使用RN诱导的CIK细胞增殖速度快,杀伤肿瘤细胞活性高,是一种安全高效的细胞培养方法。     

人脐血CD_3AK细胞生物活性及抗瘤作用的实验研究

目的　应用抗CD3单克隆抗体(CD3McAb)和重组人白细胞介素- 2(rhIL- 2)共同诱导人脐血单个核细胞以制备CD3AK细胞,动态观察其体外增殖能力、杀伤活性、免疫表型变化及分泌细胞因子水平。方法　用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定细胞杀伤活性,间接免疫荧光法分析细胞免疫表型,ELISA双抗夹心法检测肿瘤坏死因子- α(TNF- α)、干扰素 -γ(IFN- γ)、白细胞介素 -6(IL- 6)的水平。结果　脐血CD3AK细胞在第2周增殖能力最强,增殖倍数为78.56;培养至第12天的脐血CD3AK细胞杀伤活性最高,并对多种靶细胞的杀伤作用显著;表型分析脐血CD3AK细胞属异质性细胞群,培养第7、14 天,群体中 CD3+、CD8+、CD25+、CD38+、CD16+及 CD56+ 细胞较培养前显著增加(P<0.01); CD3 AK细胞培养至第 3 天的上清中 TNF -α、IFN -γ、IL -6 水平明显升高。结论　脐血CD3AK细胞是一种具有广谱杀瘤活力且增殖活性强的免疫细胞。本研究为脐血 CD3 AK细胞的免疫治疗提供了实验和理论依据。     

MGBA抗原特异性CD8~+CTL细胞与CIK细胞杀瘤活性的对比研究

目的比较乳腺珠蛋白A(MGBA)抗原特异性CD8~+CTL细胞与CIK细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。方法从健康志愿者外周血中提纯单个核细胞,体外分离、诱导培养成树突状细胞(DC)、CTL和CIK细胞,用免疫磁珠法从CTL细胞中分选CD8~+CTL细胞;用表达乳腺珠蛋白的重组腺病毒(Ad-MGBA)转染DC细胞后,经刺激制备MGBA抗原特异性CD8~+CTL与CIK细胞,用流式细胞术检测两种杀伤细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。结果 CD8~+CTL和CIK对表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-415细胞杀伤率分别是63.07%和48.35%(P<0.05);对不表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤率是14.62%和29.29%(P<0.05)。结论抗原特异性CD8~+CTL对表达该抗原的乳腺癌杀伤效果高于CIK细胞,而对不表达该抗原的乳腺癌细胞的杀伤效果低于CIK细胞。     

白细胞介素-6对脐血单个核细胞分化为树突状细胞的诱导作用

目的研究有无白细胞介素-6(IL-6)的两种不同细胞因子组合对脐血单个核细胞(CB-MNC)分化为树突状细胞(DC)的诱导作用及效率。方法通过两步法,采用两种不同细胞因子组合诱导CB-MNC分化为DC,即FST组和FST6组,分别为Flt3配体(FL)+干细胞因子(SCF)+促血小板生成素(TPO)、FL+SCF+TPO+IL-6。倒置显微镜下进行形态学观察、流式细胞仪检测其表型、比较两组间同样条件下诱导的DC数量、混合淋巴细胞反应(MLR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测培养液上清中白介素-12(IL-12)、白介素-10(IL-10)的浓度。结果 1FST组培养的细胞表面分子表达分别为CD1a(11.83±3.45)%、CD83(31.15±8.35)%、CD11c(95.18±2.92)%、CD40(93.10±5.26)%、CD86(86.24±7.17)%,同等条件下获得上述表型的细胞(2.03±0.13)×106个;2FST6组培养的细胞表面分子表达分别为CD1a(13.62±4.05)%、CD83(27.82±8.81)%、CD11c(83.29±5.31)%、CD40(85.30±6.85)%、CD86(78.86±2.23)%,同等条件下获得上述表型的细胞(2.58±0.11)×106个DC。两者均具有刺激T淋巴细胞增殖和分泌IL-12、IL-10的功能。结论 FST组和FST6组通过两步法均能成功诱导出功能性成熟的DC,FST6组诱导DC效率更高。     

TLR4/9介导牙周炎宿主CD25+B细胞表达IL-10、IL-35及TGF-β的效应及机制

目的 分析牙周炎宿主CD25⁺B细胞中IL-10、IL-35及TGF-β的表达特点,评价TLR4/9的表达活化对上述过程的影响。方法 SD大鼠随机分为健康组、早期牙周炎组、晚期牙周炎组,采用结扎法建立牙周炎模型。检测各组动物牙龈及外周血CD25⁺B细胞内IL-10、IL-35和TGF-β mRNA的表达水平,牙龈CD25⁺B细胞内TLR 2/4/7/9、MyD88、TRAF6的表达活化水平。建立细胞培养体系,分析TLRs/MyD88信号对CD25⁺B细胞表达分泌IL-10、IL-35和TGF-β的影响。结果 早期牙周炎组牙龈CD25⁺B细胞内IL-10、TGF-β mRNA表达水平高于健康组(P<0.05)。晚期牙周炎组牙龈CD25⁺B细胞内IL-10、IL-35及TGF-β mRNA表达水平高于健康组(P<0.05),外周血CD25⁺B细胞内IL-10 mRNA高于健康组(P<0.05),余差异无统计学意义(P&g...     

带状疱疹患者水痘-带状疱疹病毒再激活阶段免疫机制分析

目的 研究带状疱疹患者水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)再激活阶段的免疫细胞与细胞因子的变化规律。方法 选取西安市第九医院2022年5月至2022年10月期间50例带状疱疹患者和30例健康对照者。采用流式细胞技术检测外周血CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞及B细胞和NK细胞比例,以及血清中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10和IL-6水平。分析带状疱疹患者VZV再激活阶段免疫机制。结果 与健康对照组相比,带状疱疹患者CD3⁺和CD4⁺T细胞比例下降明显;NK细胞比例显著升高;血清中IFN-γ、IL-10以及IL-6水平显著升高;CD8⁺T细胞、B细胞比例和IL-2含量有升高的趋势,但差异并无统计学意义。此外,带状疱疹患者神经受累严重程度可能影响细胞因子水平的变化。结论 在VZV再激活期间,免疫细胞比例和细胞因子水平的变化与带状疱疹的发生和发展密切相关。     

WT1多肽疫苗对荷人单核细胞白血病SCID小鼠的抗肿瘤免疫效应

目的研究WT1多肽疫苗对荷人单核细胞白血病重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的抗肿瘤免疫效应。方法对SCID小鼠腹腔注射人外周血淋巴细胞(PBL)后24h,皮下接种THP1细胞,建立SCID小鼠荷人单核细胞白血病模型,随机分组,每组8只。空白对照组的疫苗成分为不完全弗氏佐剂,辅助T细胞表位组的疫苗成分为辅助T细胞表位和不完全弗氏佐剂,WT1多肽组的疫苗成分为WT1多肽、辅助T细胞表位和不完全弗氏佐剂。当肿瘤体积约为100mm3时,开始腹腔注射疫苗成分,疫苗接种14d后处死SCID小鼠。采用乳酸脱氢酶法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤活性,肿瘤组织HE染色后镜下观察组织学特点,利用流式细胞仪检测外周血CD3~+/CD4~+T细胞、CD3~+/CD8~+T细胞及CD4~+CD25~+T细胞水平,应用ELISA方法检测血清中免疫球蛋白、IL-2、IFN-γ、TGF-β及IL-10水平。结果实验成功建立荷人单核细胞白血病SCID小鼠模型,各组中所有动物均成瘤;WT1组小鼠脾细胞对THP1细胞的CTL活性高于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05);WT1组小鼠的肿瘤平均体质量及体积均明显低于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05);WT1组肿瘤组织HE染色显示肿瘤细胞变性坏死,存活的肿瘤细胞减少;WT1组小鼠外周血CD3~+/CD4~+T细胞、CD3~+/CD8~+T细胞、IgG、IFN-γ和IL-2水平均明显高于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05);外周血CD4~+/CD25~+Treg细胞、TGF-β和IL-10水平均明显低于辅助T细胞表位组和空白对照组(P<0.05)。结论 WT1多肽疫苗可在荷人单核细胞白血病SCID小鼠体内产生抗肿瘤免疫效应,有效杀伤白血病细胞。     

白细胞介素-12对哮喘患者Th细胞的作用

目的　观察白细胞介素 12 (IL 12 )对哮喘患者辅助性T淋巴细胞 (Th)的分化和细胞因子分泌的影响 ,探讨IL 12对哮喘治疗的机制及应用。方法　从哮喘患者外周血分离出单核细胞和CD4 + T(Th)细胞 ,单核细胞被尘螨变应原刺激活化后同CD4 + T细胞分别与 1μg·L-1和 5 μg·L-1IL 12共培养 ,对照组不加IL 12。 72h后收集培养上清 ,ELISA法检测IL 4、IL 5和IFN γ的生成量。培养细胞用荧光标记的单克隆抗体染色 ,流式细胞仪 (FCM)检测细胞内特异性细胞因子。结果　与对照组相比 ,实验组IL 4、IL 5的产生量明显减少 ,IFN γ的产生量显著增加 (P <0 .0 1) ,而且这种变化趋势在 1μg·L-1、5 μg·L-1IL 12间也有统计学差异 (P <0 .0 5 )。实验组Th1/Th2向Th1方向漂移 ,Th1/Th2增加 (P<0 .0 1)。结论　IL 12可调节Th的分化方向及不同类型细胞因子的分泌 ,并在一定浓度范围内呈量效依赖性。提示IL 12可作为一种新的哮喘治疗途径     

急性心肌梗死患者应用粒-巨噬细胞集落刺激因子后血CD34~+细胞和炎性因子的变化

目的观察急性心肌梗死患者应用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)后,外周血CD34+细胞的变化,探讨GM-CSF对炎性因子的影响。方法20例急性心肌梗死患者被随机分为GM-CSF[10μg/(kg.d),共7 d]组和对照组(生理盐水)。应用流式细胞仪检测患者外周血CD34+细胞的绝对计数。应用酶联免疫法及放射免疫法检测两组患者及10例健康者血C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果与对照组相比,GM-CSF组在应用GM-CSF后外周血CD34+细胞数明显增高,于第7天达到高峰(P<0.05);心肌梗死患者血CRP、IL-6及TNF-α水平均明显高于健康者(P<0.05);GM-CSF组与对照组相比,CRP水平从第3天时开始升高,第10天时较对照组有明显的差别(P<0.05);两心梗组在IL-6及TNF-α水平上均无统计学意义的差别。结论GM-CSF可有效的动员急性心肌梗死患者外周血CD34+细胞,亦可增加CRP的水平。     

白细胞介素-2协同白细胞介素-18活化自然杀伤细胞活性的作用

目的研究白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-18(IL-18)诱导自然杀伤(NK)细胞活化和抗骨髓瘤细胞活性的协同作用。方法流式细胞仪方法检测NK细胞表面CD69的表达;阴性细胞纯化法用于获得高纯度的NK细胞;ELISA测定NK细胞培养上清液中干扰素(IFN-γ)的浓度;标准铬51释放试验评估NK细胞杀伤骨髓瘤细胞的能力。结果与单一应用IL-18相比,低浓度IL-2和IL-18联合应用显著提高了NK细胞的活性、分泌干扰素(IFN-γ)的水平和杀伤骨髓瘤细胞的作用。结论低浓度IL-2具有协同IL-18活化NK细胞抗骨髓瘤细胞的作用,此结果为IL-2和IL-18联合应用治疗骨髓瘤奠定了一定的理论基础。     

鼻咽癌组织中BCRF-1基因表达及其与免疫功能的相关性分析

目的研究鼻咽癌组织中BCRF-1mRNA及病毒白介素-10(VIL-10)蛋白质的表达,明确VIL-10对鼻咽癌患者免疫细胞的影响。方法在鼻咽癌组织和鼻咽炎症组织中,分别应用RT-PCR及Western Blot检测BCRF-1mRNA和蛋白产物VIL-10的表达;流式细胞术检测两组患者外周血CD4+T、CD8+T细胞的比例。结果①BCRF-1mR-NA在34/40例(85%)鼻咽癌组织和16/20例(80%)鼻咽炎症组织中表达阳性,两者差异无统计学意义(P>0.05)。②30/40例(75%)鼻咽癌组织VIL-10呈阳性,10/20例(50%)鼻咽炎症组织VIL-10呈阳性,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。③40例鼻咽癌患者分为VIL-10阳性组和VIL-10阴性组,VIL-10阳性鼻咽癌患者组CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T比值明显低于VIL-10阴性鼻咽癌患者组(24.99%±3.88%vs.35.92%±6.31%,0.86 vs.1.99,均P<0.05),而VIL-10阳性鼻咽癌患者组CD8+T细胞明显高于VIL-10阴性鼻咽癌患者组(30.61%±3.34%vs.20.10%±7.68%,P<0.05)。结论鼻咽癌组织中高表达BCRF-1基因及其蛋白产物VIL-10;VIL-10使鼻咽癌患者的免疫细胞发生偏移,发挥免疫抑制作用。     

肺癌患者外周血T细胞亚群及免疫细胞活性的研究

采用 APAAP法和流式细胞仪研究 32例肺癌患者及 30例健康人外周血T细胞亚群及免疫细胞活性 ( NK- A)的变化。结果表明 :肺癌患者外周血 CD+3 、CD+4、CD+4/CD+8及 NK- A与正常人比较呈显著性降低 ( P <0 .0 5 ,P <0 .0 1 ) ;且肺癌伴癌转移者与未转移者上述各项指标亦有显著性差异 ( P <0 .0 5 )。说明肺癌患者存在细胞免疫功能降低 ;伴有癌转移的肺癌患者细胞免疫功能更低。提出积极调节肺癌患者细胞免疫功能 ,增强机体抗肿瘤能力十分重要。     

肺炎支原体下呼吸道感染患儿外周血辅助性T细胞亚群Th1/Th2及B细胞的研究

目的　探讨辅助性T淋巴细胞亚群Th1/Th2及B细胞在肺炎支原体 (MP)下呼吸道感染患儿免疫学发病机制中的作用。方法　应用流式细胞仪单克隆抗体免疫荧光标记法 ,对 30例MP下呼吸道感染患儿的外周血B淋巴细胞CD19+ 及辅助性T淋巴细胞Th1亚群CD4 + CD4 5RA+ 、Th2亚群CD4 + CD4 5RO+ 的表达情况进行研究。结果　MP下呼吸道感染患儿外周血B淋巴细胞CD19+ 表达明显升高。辅助性T淋巴细胞Th1亚群CD4 +CD4 5RA+ 表达明显升高 ,Th2亚群CD4 + CD4 5RO+ 表达无显著性变化。CD4 + CD4 5RA+ /CD4 + CD4 5RO+ 明显升高。结论　MP下呼吸道感染患儿存在多种免疫失衡和紊乱情况 ,主要表现为Th1细胞为主的免疫反应及B淋巴细胞过度增殖 ,符合自身免疫性疾病的免疫病理基本特征 ,推测MP下呼吸道感染与自身免疫性疾病密切相关     

鼻咽癌患者中CD4~+CD25~+T细胞与CCR4的相关性

目的 探讨鼻咽癌患者全身及肿瘤局部的免疫状态及其与CC类趋化因子受体-4(CCR4)的关系.方法 采用流式细胞术检测初诊鼻咽癌患者组织(25例)及外周血(35例)中CD4~+CD25~+T细胞与CCR4阳性细胞在淋巴细胞中的比例,并进行统计学分析.结果 鼻咽癌组织及外周血中CD4~+CD25~+T细胞及CCR4阳性细胞的比例高于对照组(P<0.05);两种细胞在鼻咽癌组织中的比例高于外周血(P<0.05),而对照组外周血与组织中却无明显差别(P>0.05);鼻咽癌Ⅲ+Ⅳ期组织中的 CD4~+CD25~+T细胞比例高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05),外周血中两组无明显差别(P>0.05);鼻咽癌组织及外周血中的CD4~+CD25~+T细胞与CCR4阳性细胞存在正相关关系.结论 鼻咽癌患者存在不同程度的免疫抑制,肿瘤局部免疫抑制更为严重;CD4~+CD25~+T细胞的比例与鼻咽癌分期相关,分期越晚,该细胞比例越高;CCR4在介导CD4~+CD25~+T 细胞趋化到肿瘤局部的过程中起了一定作用.     

参芪注射液对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的细胞免疫机制

目的研究参芪注射液的体内抑瘤效应与荷瘤机体细胞免疫功能的关系,探讨其抑瘤作用的细胞免疫学机制。方法建立小鼠H22肝癌实体瘤模型,分别给予高、中、低剂量参芪注射液,测定各组小鼠肿瘤生长抑制率(IR)和腹腔巨噬细胞的吞噬指数;采用MTT法测定各组小鼠脾淋巴细胞增殖指数;ELISA法检测各组小鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(IFN-γ)水平。结果高、中剂量参芪注射液实验组小鼠H22实体瘤IR分别为60.72%和48.65%,与模型组比较有显著性差异(P<0.05);参芪注射液实验组小鼠脾脏淋巴细胞增值指数、腹腔巨嗜细胞吞噬指数、血清IL-2和IFN-γ的含量都显著高于模型组小鼠(P<0.05)。结论参芪注射液通过提高荷瘤小鼠的细胞免疫功能,改善荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫状态,协同对肿瘤细胞的直接杀伤作用,在荷瘤小鼠体内发挥其抑瘤抗瘤作用。     

高糖对MMP-2与TIMP-2的表达及血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨高糖作用下大鼠胸主动脉平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其组织抑制剂-2(TIMP-2)的表达情况及高糖对血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响。方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养及传代后,分为正常浓度葡萄糖组(NG组,5.5mmol/L葡萄糖)、甘露醇高渗对照组(5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇)、高浓度葡萄糖组(HG组,25mmol/L葡萄糖)和GM6001组(25mmol/L葡萄糖+5μmol/L GM6001),在4组不同的培养环境下分别培养72h后,用RT-PCR技术检测MMP-2与TIMP-2的表达情况,同时用MTT比色法检测4种不同培养环境下VSMCs的增殖情况。结果 HG组与NG组相比,MMP-2与TIMP-2mRNA的表达增强,差异具有统计学意义(P<0.01),甘露醇高渗对照组、GM6001组与NG组相比,MMP-2与TIMP-2mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05);HG组与NG组相比,MMP-2与TIMP-2 mRNA的相对表达量的比值显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01),甘露醇高渗对照组、GM6001组与NG组相比差异无统计学意义(P>0.05);HG组各时间点细胞增殖与NG组相比差异具有统计学意义(P<0.05),而GM6001组、甘露醇高渗对照组各时间点的细胞增殖与NG组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论高浓度葡萄糖促进血管平滑肌细胞增殖,这可能是通过MMP-2与TIMP-2表达失衡介导的。