脐血树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞协同抗急性白血病细胞效应及生物学活性研究

目的研究脐血树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤(DC-CIK)细胞的体外增殖、免疫表型、分泌细胞因子水平及其对急性白血病细胞细胞毒作用的影响。方法采集脐血单个核细胞诱导DC和CIK细胞。将DC和CIK细胞按1∶5的比例混合培养,以脐血CIK细胞或外周血DC-CIK细胞为对照。用流式细胞术分析细胞表型,台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法检测效应细胞杀伤白血病细胞的活性,ELISA法测定分泌干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果脐血DC-CIK细胞的增殖能力显著高于脐血CIK细胞和外周血DC-CIK细胞(P均<0.05);脐血DC、CIK细胞共培养后,CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例较同条件下CIK细胞明显增多(P<0.05);混合培养3 d,脐血DC-CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α含量均比CIK细胞单纯培养的分泌量高(P<0.01或P<0.05);在2.5∶1～20∶1的效靶范围内,脐血DC-CIK细胞对各亚型急性白血病细胞的杀伤率明显高于CIK细胞(P<0.05),且对各亚型白血病细胞杀伤活性无统计学意义,与外周血DC-CIK细胞对白血病杀伤效应相类同。结论脐血DC可增强同源CIK细胞的增殖活性和抗白血病效应。脐血DC-CIK细胞增殖能力比外周血DC-CIK细胞强,但两者在细胞毒方面无显著性差异。脐血来源丰富,且输注不易引起严重的移植物排斥反应,其DC-CIK细胞在免疫治疗方面应有更广泛的临床应用前景。     

DC-CIK细胞的生物学活性及抗淋巴瘤细胞的作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后DC-CIK细胞的体外增殖能力、免疫表型变化、分泌细胞因子水平以及抗淋巴瘤细胞活性。方法正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用台盼蓝活细胞计数计算细胞扩增倍数,MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA双抗体夹心法检测分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)的水平。结果DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞(P<0.05);DC、CIK细胞共培养后,CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞比率较同条件下CIK细胞组显著增多(P<0.05);共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、INF-γ的分泌量均比CIK细胞单独培养的分泌量高(P<0.01,P<0.05);在5∶1-40∶1的效靶比范围内,DC-CIK细胞对淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞(P<0.05),且杀伤率与效靶比呈正相关。结论DC-CIK细胞的增殖能力、分泌细胞因子水平、抗淋巴瘤细胞活性均高于CIK细胞,为DC-CIK细胞免疫治疗提供了实验和理论依据。     

重组人纤维连接蛋白对无血清培养的CIK细胞增殖及对K562细胞杀伤活性的影响

目的探讨重组人纤维连接蛋白(RetroNectin,RN)诱导的细胞因子诱导的杀伤细胞CIK增殖、免疫特性及对人类K562细胞杀伤活性的影响。方法密度梯度分离法分离外周血单个核细胞后分成两组,应用CD3单抗、IFN-γ、IL-2培养CIK细胞,一组含RN(RN组),一组不含RN(Non-RN组)。记录两组细胞增殖速度;用流式细胞术动态测定免疫细胞表型;用CBA细胞因子试剂盒检测IFN-γ、TNF-α及IL-4的分泌;用CFSE/PI双标法测定CIK细胞对人红白血病细胞株(K562)的体外杀伤活性。结果 RN组细胞生长明显快于Non-RN组(P<0.05);CD3+CD8+的细胞随着时间的延长逐渐增多,但两组间比较无统计学差异;CD3+CD56+细胞所占百分比在第5天和第10天时两组间比较均无统计学差异(P>0.05),在第15天时RN组有大幅度升高,第15、20、25天两组比较均有统计学差异(P<0.05)。细胞毒杀伤活性结果显示,RN组与Non-RN组对K562细胞毒活性亦有统计学差异。两组间细胞因子IFN-γ、TNF-α随着培养时间的延长,分泌量逐渐升高。结论使用RN诱导的CIK细胞增殖速度快,杀伤肿瘤细胞活性高,是一种安全高效的细胞培养方法。     

CD_3 McAb联合rhIL-2激活的骨髓对白血病细胞杀伤净化作用的研究

目的　探讨CD3单克隆抗体 (CD3McAb)联合重组人白细胞介素 2 (rhIL 2 )激活的骨髓对白血病细胞的杀伤及净化作用。方法　用MTT法检测激活骨髓的细胞毒作用 ;半固体集落培养法观察激活骨髓CFU GM水平和对白血病细胞的净化作用 ;采用间接荧光法测定激活骨髓的免疫标记。结果　CD3McAb与rhIL 2联合激活的骨髓对白血病细胞株K5 6 2、HL 6 0均有明显的杀伤净化作用 ,且优于rhIL 2或CD3McAb单用组 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。rhIL 2和 (或 )CD3McAb对激活骨髓的CFU GM水平无明显影响。CD3McAb +rhIL 2激活的骨髓 ,与活化前及rhIL 2或CD3McAb组相比 ,CD3+ 、CD8+ 、CD1 9+ 、CD2 5+ 、CD38+ 、CD56+ 细胞显著升高。结论　CD3McAb能增强rhIL 2激活的骨髓对白血病细胞的杀伤及净化作用     

急性心肌梗死患者应用粒-巨噬细胞集落刺激因子后血CD34~+细胞和炎性因子的变化

目的观察急性心肌梗死患者应用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)后,外周血CD34+细胞的变化,探讨GM-CSF对炎性因子的影响。方法20例急性心肌梗死患者被随机分为GM-CSF[10μg/(kg.d),共7 d]组和对照组(生理盐水)。应用流式细胞仪检测患者外周血CD34+细胞的绝对计数。应用酶联免疫法及放射免疫法检测两组患者及10例健康者血C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果与对照组相比,GM-CSF组在应用GM-CSF后外周血CD34+细胞数明显增高,于第7天达到高峰(P<0.05);心肌梗死患者血CRP、IL-6及TNF-α水平均明显高于健康者(P<0.05);GM-CSF组与对照组相比,CRP水平从第3天时开始升高,第10天时较对照组有明显的差别(P<0.05);两心梗组在IL-6及TNF-α水平上均无统计学意义的差别。结论GM-CSF可有效的动员急性心肌梗死患者外周血CD34+细胞,亦可增加CRP的水平。     

白细胞介素-2协同白细胞介素-18活化自然杀伤细胞活性的作用

目的研究白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-18(IL-18)诱导自然杀伤(NK)细胞活化和抗骨髓瘤细胞活性的协同作用。方法流式细胞仪方法检测NK细胞表面CD69的表达;阴性细胞纯化法用于获得高纯度的NK细胞;ELISA测定NK细胞培养上清液中干扰素(IFN-γ)的浓度;标准铬51释放试验评估NK细胞杀伤骨髓瘤细胞的能力。结果与单一应用IL-18相比,低浓度IL-2和IL-18联合应用显著提高了NK细胞的活性、分泌干扰素(IFN-γ)的水平和杀伤骨髓瘤细胞的作用。结论低浓度IL-2具有协同IL-18活化NK细胞抗骨髓瘤细胞的作用,此结果为IL-2和IL-18联合应用治疗骨髓瘤奠定了一定的理论基础。     

白细胞介素-6对脐血单个核细胞分化为树突状细胞的诱导作用

目的研究有无白细胞介素-6(IL-6)的两种不同细胞因子组合对脐血单个核细胞(CB-MNC)分化为树突状细胞(DC)的诱导作用及效率。方法通过两步法,采用两种不同细胞因子组合诱导CB-MNC分化为DC,即FST组和FST6组,分别为Flt3配体(FL)+干细胞因子(SCF)+促血小板生成素(TPO)、FL+SCF+TPO+IL-6。倒置显微镜下进行形态学观察、流式细胞仪检测其表型、比较两组间同样条件下诱导的DC数量、混合淋巴细胞反应(MLR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测培养液上清中白介素-12(IL-12)、白介素-10(IL-10)的浓度。结果 1FST组培养的细胞表面分子表达分别为CD1a(11.83±3.45)%、CD83(31.15±8.35)%、CD11c(95.18±2.92)%、CD40(93.10±5.26)%、CD86(86.24±7.17)%,同等条件下获得上述表型的细胞(2.03±0.13)×106个;2FST6组培养的细胞表面分子表达分别为CD1a(13.62±4.05)%、CD83(27.82±8.81)%、CD11c(83.29±5.31)%、CD40(85.30±6.85)%、CD86(78.86±2.23)%,同等条件下获得上述表型的细胞(2.58±0.11)×106个DC。两者均具有刺激T淋巴细胞增殖和分泌IL-12、IL-10的功能。结论 FST组和FST6组通过两步法均能成功诱导出功能性成熟的DC,FST6组诱导DC效率更高。     

体外诱导人脐血CD34~+细胞向肝细胞的分化

目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/L FBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞。通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%,达到分离要求。RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。     

慢性粒细胞白血病树突状细胞的体外无血清培养及杀瘤效应

目的　建立慢性粒细胞白血病 (CML)树突状细胞 (DCs)体外无血清培养体系。方法　小牛血清 (FCS)、无血清 (SFM)及自体血清分别培养CML病人CD34 + 细胞或单个核细胞 (MNCs) ,以SCF、GM CSF、TNF α、IL 4 (A)与GM CSF、TNF α、IL 4 (B)两组不同的细胞因子作对照。结果　CML DCsHLA DR高表达 ,CD80、CD83和CD86表达比例不高 ,异体混合淋巴细胞反应能力不强。SFM同FCS体系相比无显著差异。 5例CML DCsPh染色体比例与培养前MNCsPh染色体比例基本吻合 ;同时以CML DCs同自身T细胞、自体Ph+ MNCs共孵育 ,测其杀伤率为 (38.5± 6 .5 ) %。结论　CML DCs携带Ph染色体 ,能刺激自体T细胞杀伤自身白血病细胞 ,但需进一步改善其功能。     

MGBA抗原特异性CD8~+CTL细胞与CIK细胞杀瘤活性的对比研究

目的比较乳腺珠蛋白A(MGBA)抗原特异性CD8~+CTL细胞与CIK细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。方法从健康志愿者外周血中提纯单个核细胞,体外分离、诱导培养成树突状细胞(DC)、CTL和CIK细胞,用免疫磁珠法从CTL细胞中分选CD8~+CTL细胞;用表达乳腺珠蛋白的重组腺病毒(Ad-MGBA)转染DC细胞后,经刺激制备MGBA抗原特异性CD8~+CTL与CIK细胞,用流式细胞术检测两种杀伤细胞对乳腺癌细胞的杀伤效果。结果 CD8~+CTL和CIK对表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-415细胞杀伤率分别是63.07%和48.35%(P<0.05);对不表达MGBA抗原的乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤率是14.62%和29.29%(P<0.05)。结论抗原特异性CD8~+CTL对表达该抗原的乳腺癌杀伤效果高于CIK细胞,而对不表达该抗原的乳腺癌细胞的杀伤效果低于CIK细胞。     

α-干扰素对慢性粒细胞白血病来源的树突状细胞的免疫调节作用(Ⅰ)

目的　于慢性粒细胞白血病 (CML)来源的树突状细胞 (DCs)无血清培养基中 ,加入α 干扰素 (IFN α) ,以探讨IFN α对CML DCs表达共刺激分子及分泌IL 10、IL 12P70的影响。方法　在诱导CML DCs的培养基中 ,除加入SCF、GM CSF、TNF α及IL 4外 ,还加入不同浓度IFN α。培养 10～ 14d后 ,流式细胞仪检测细胞免疫表型 ;G显带法显示Ph1染色体 ;噻唑蓝 (MTT)法检测CML DCs刺激正常人外周血淋巴细胞增殖状况 ;ELISA法检测培养上清IL 10及IL 12P70含量。结果　IFN α(30 0U·mL-1)组较无IFN α组 ,CML DCs的CD4 0、CD83、CD86及MHC I类抗原的表达均升高一倍 ;异体混合淋巴细胞反应 (MLR)中OD值增加一倍 ;Ph1染色体阳性比例、IL 10及IL 12P70浓度均减低。结论　IFN α能够部分纠正CML DCs免疫表型及功能缺陷 ,同其解除了CML血清中IL 10对CML DCs分化的抑制有关     

CD_3AK细胞对白血病细胞的体外杀伤作用

ＣＤ３单克隆抗体（ＣＤ３ＭｃＡｂ）对Ｔ细胞具有强烈的丝裂原作用。本文显示将ＣＤ３ＭｃＡｂ联合ＩＬ－２激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ）对人急性白血病新鲜细胞和Ｋ５６２细胞均有明显杀伤作用。正常人ＣＤ３ＡＫ细胞对各型急性白血病杀伤活性无差别;正常人与白血病缓解期的ＣＤ３ＡＫ细胞杀伤力类同,且自体与异体亦无区别;但是,复发期ＣＤ３ＡＫ细胞杀瘤作用明显减弱。     

实验性肝硬化大鼠细胞因子IL-18、TNF-α、IFN-γ的变化及意义

目的 探讨在四氯化碳(CCl4) 复合因素诱导实验性肝硬化大鼠的形成过程中,白介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的变化及意义.方法 将80只清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组和造模2周组、4周组、6周组,每组20只.予以CCl4复合因素诱导大鼠肝硬化,并在2、4、6周3个时间点分别处死6只大鼠.采用ELISA法检测大鼠血清IL-18、TNF-α、IFN-γ和肝脏组织匀浆上清液中的IL-18含量;HE染色观察肝脏的组织病理学变化.结果 ①CCl_4复合因素诱导的实验性大鼠,组织病理学观察发现,2周时大鼠肝脏组织细胞肿胀变性,6周时有大量纤维增生,部分肝组织有假小叶的形成;②随着造模时间的延长,实验大鼠血清IL-18、TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高,造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);③造模组肝脏组织匀浆中IL-18随肝损害程度的加重而升高,造模6周组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 在CCl_4复合因素诱导大鼠肝硬化的形成过程中,IL-18、TNF-α、IFN-γ水平逐渐升高,提示该3种细胞因子与肝硬化的形成及发展有关.     

白细胞介素-12对哮喘患者Th细胞的作用

目的　观察白细胞介素 12 (IL 12 )对哮喘患者辅助性T淋巴细胞 (Th)的分化和细胞因子分泌的影响 ,探讨IL 12对哮喘治疗的机制及应用。方法　从哮喘患者外周血分离出单核细胞和CD4 + T(Th)细胞 ,单核细胞被尘螨变应原刺激活化后同CD4 + T细胞分别与 1μg·L-1和 5 μg·L-1IL 12共培养 ,对照组不加IL 12。 72h后收集培养上清 ,ELISA法检测IL 4、IL 5和IFN γ的生成量。培养细胞用荧光标记的单克隆抗体染色 ,流式细胞仪 (FCM)检测细胞内特异性细胞因子。结果　与对照组相比 ,实验组IL 4、IL 5的产生量明显减少 ,IFN γ的产生量显著增加 (P <0 .0 1) ,而且这种变化趋势在 1μg·L-1、5 μg·L-1IL 12间也有统计学差异 (P <0 .0 5 )。实验组Th1/Th2向Th1方向漂移 ,Th1/Th2增加 (P<0 .0 1)。结论　IL 12可调节Th的分化方向及不同类型细胞因子的分泌 ,并在一定浓度范围内呈量效依赖性。提示IL 12可作为一种新的哮喘治疗途径     

RSV下呼吸道感染患儿辅助性T细胞亚群Th1/Th2及相关因子的研究

目的　探讨辅助性T淋巴细胞Th1 /Th2亚群及其相关细胞因子IFN γ、IL 4在呼吸道合胞病毒 (RSV)下呼吸道感染患儿发病机制中的作用。方法　用单克隆抗体双色免疫荧光FITC/PE双标记 ,流式细胞仪检测 3 0例RSV下呼吸道感染患儿急性期外周血单个核细胞(PBMCs)辅助性T淋巴细胞CD+4及其Th1亚群CD+4CD45RA+,Th2亚群CD+4CD45RO+的表达 ,并用ELISA方法同时检测患儿血清中细胞因子IFN γ、IL 4水平。同期检测 1 5例年龄、性别无差异的健康婴儿为对照。结果　RSV下呼吸道感染组患儿外周血辅助性T淋巴细胞CD+4明显低于对照组 (P <0 .0 5 ) ,Th1细胞CD+4CD45RA+明显下降 (P <0 .0 5 ) ,Th2细胞CD+4CD45RO+虽有下降 ,但与对照组相比无统计学差异 (P >0 .0 5 )。Th1 /Th2比值与对照组相比明显降低 (P <0 .0 5 )。RSV下呼吸道感染组患儿血清中IFN γ、IL 4水平均有降低 ,以IFN γ水平下降最为明显 (P <0 .0 1 ) ,IFN γ/IL 4比值降低 (P <0 .0 5 )。结论　婴幼儿RSV下呼吸道感染急性期的免疫功能紊乱主要表现为Th1及其功能下降 ;Th2及其功能相对增强 ,Th1 /Th2的失衡是导致该病发生Th2样反应的重要免疫机制。