c-FLIP蛋白与卵巢癌细胞对TRAIL耐药抵抗的关系

目的探索卵巢癌细胞对TRAIL诱导凋亡耐药抵抗的机制。方法分别选择12.5、25、50、100ng/mL的人重组TRAIL蛋白作用于卵巢癌细胞3AO和CAOV3,在18、24、48、72h时间点收集细胞,MTT法检测细胞的生长抑制率;原位末端标记法(TUNEL)观察凋亡细胞;流式细胞仪(FCM)检测细胞的凋亡率;Western blot检测凋亡抑制蛋白c-FLIP蛋白表达的水平。结果 TRAIL抑制了3AO和CAOV3细胞的生长增殖,24h3AO、CAOV3细胞的生长抑制率分别为28%、10%,并且TRAIL增多可诱导细胞凋亡,24h的3AO细胞凋亡率(8.5%)明显高于CAOV3(5.5%)。CAOV3细胞中c-FLIP蛋白的表达水平高于3AO细胞。结论 c-FLIP蛋白是卵巢癌细胞对TRAIL耐药抵抗的一种重要调控蛋白。     

β肾上腺素能受体阻断剂诱导胰腺癌细胞株PC-2凋亡的实验研究

目的 观察β肾上腺素能受体阻断剂是否通过诱导胰腺癌细胞凋亡而产生抑制效应.方法 利用特异性β1肾上腺素能受体阻断剂美托洛尔、广谱β肾上腺素能受体阻断剂普萘洛尔、特异性β2肾上腺素能受体阻断剂丁氧胺干预诱导人胰腺癌PC-2细胞.RT-PCR和Western blot检测PC-2细胞β受体的表达.用Hoechst 33342荧光染色,TUNEL染色和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪观察和分析PC-2细胞凋亡情况,用Western blot检测Caspase-3,Caspase-9和Caspase-8的表达.结果 PC-2细胞表达β1和β2肾上腺素受体,尤以β2受体的表达占优势.Hoechst 33342荧光染色、TUNEL染色和流式细胞仪分析表明三种受体阻断剂均诱导了PC-2细胞的凋亡,TUNEL染色法结果显示丁氧胺诱导的细胞凋亡率[(15.4±1.99)%]强于普萘洛尔[(11.25±1.95)%],而普萘洛尔诱导的细胞凋亡率优于美托洛尔[(7.62±1.46)%].流式检测结果显示丁氧胺诱导的细胞凋亡率[(16.2±1.58)%]优于普萘洛尔[(14.7±1.96)%],而普萘洛尔诱导的细胞凋亡率高于美托洛尔[(6.29±1.77)%].Western blot分析显示三种受体阻断剂诱导了Caspase-3和Caspase-9活性片段的表达,而Caspase-8未受影响.结论 β肾上腺素能受体阻断剂可诱导胰腺癌细胞凋亡,主要是通过阻断β2受体发挥内源性凋亡效应.     

甲胎蛋白对人肝癌Bel 7402细胞caspase信号传递及耐受TRAIL的影响

目的 研究甲胎蛋白(AFP)对人肝癌Bel 7402细胞内caspase信息通路信号传递的影响,以及对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导肝癌细胞凋亡的对抗作用.方法 激光共聚焦显微镜观察AFP与caspase-3、caspase-8 在Bel 7402细胞内的共定位;免疫共沉淀(Co-IP)技术研究AFP与caspase-3、caspase-8的相互作用;RNA干扰(RNAi)技术封阻AFP表达,并用Western blotting检测RNAi干扰肝癌Bel 7402细胞内AFP表达的效果;用蛋白酶活性比色法检测AFP对肝癌细胞 caspase-3、caspase-8活性的影响;MTT法分析干扰AFP表达30 h后再给予TRAIL(2nmol/L)处理24 h,Bel 7402细胞的生长情况,并用荧光显微镜观察经TRAIL处理后肝癌细胞的凋亡状况.结果 共聚焦显微镜观察发现AFP、caspase-3、caspase-8主要表达于Bel 7402细胞的细胞质,发现AFP能与 caspase-3共定位于细胞质,但与caspase-8在细胞质的共定位可能性很小;Co IP技术研究发现AFP能与caspase-3结合,但不能与caspase-8结合;2nmol/L 剂量的TRAIL单独处理Bel 7402细胞并不能显著改变caspase-3活性,但能提升caspase-8活性,而用全反式维甲酸(ATRA)40 μmol/L加TRAIL(2nmol/L)处理时,则能提高Bel 7402细胞caspase-3活性;干扰AFP表达后,单独用TRAIL(2nmol/L)也能激活caspase-3,而干扰AFP表达前后对caspasE-8活性没有显著性改变;MTT分析发现, 2nmol/L剂量的TRAIL对Bel 7402细胞的生长并没有显著性抑制作用,但是干扰AFP表达后TRAIL(2nmol/L)能明显抑制Bel 7402细胞生长(抑制率为48.4%);荧光显微镜观察表明,干扰AFP表达后TRAIL(2nmol/L)能诱导Bel 7402细胞凋亡.结论 AFP选择性抑制caspasE-3活性是阻断人肝癌Bel 7402细胞内凋亡信息传递的重要机制,也是AFP抵抗TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的关键环节.     

氧化应激通过激活Cdk5抑制FOXO1的神经元损伤及其机制

目的探究氧化应激通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5)抑制叉头框转录因子O亚家族蛋白1(forkhead box O1, FOXO1)的神经元损伤的具体机制。方法在HEK细胞中,共同转染过表达P39/Cdk5和FOXO1-WT或者FOXO1-S249A突变体,利用特异性磷酸化抗体pS249-FOXO1能够特异识别FOXO1的Ser249位点磷酸化特点,通过Western blot检测Cdk5/p39对FOXO1的磷酸化。通过体外培养HEK细胞中过表达Cdk5、p39和FOXO1,免疫共沉淀探究Cdk5和FOXO1以及Cdk5和p39的相互作用。在原代神经元过表达不同的Cdk5激活因子(p25、p35、p39)以及Cdk5激酶复合物,使用双荧光素酶实验探究其不同组合对FOXO1转录活性的影响。用Cdk5抑制剂rocovitine干预,观察其对FOXO1出入的影响;同时通过核质分离的方法对比了Cdk5杂合小鼠和野生型大脑皮层组织的FOXO1核质定位。分别用H_2O_2、glutamate处理神经元,通过Western blot观察氧化应激对Cdk5的活性调节,同时用双荧光素酶实验探究其对FOXO1转录因子的影响;最后通过caspase-3染色观察H_2O_2、glutamate的不同时间梯度处理对神经元凋亡的影响。结果 Cdk5和p39能够直接与FOXO1相互作用,并磷酸化FOXO1的Ser249位点。激活Cdk5能够显著抑制FOXO1的转录活性,而用Cdk5抑制剂(roscovitine)能够显著提高FOXO1的转录活性并诱导FOXO1入核。与野生型对比,在Cdk5杂合子中,FOXO1蛋白在细胞核中定位显著提高。H_2O_2和glutamate处理诱导p35切割形成p25,同时抑制FOXO1的转录活性,而敲低Cdk5能够缓解H_2O_2和glutamate对FOXO1的转录活性的抑制。通过H_2O_2和glutamate处理的原代神经元,caspase3染色显著增加。结论 Cdk5/p39可以磷酸化FOXO1-ser249位点,并抑制FOXO1的转录活性;而氧化应激能够通过激活Cdk5,抑制FOXO1的转录活性,并诱导神经元凋亡。     

生存素在5-氟尿嘧啶诱导人绒癌细胞株JAR凋亡中的作用

目的探讨生存素(survivin)在化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导的人绒癌细胞株(JAR)凋亡中的作用。方法用JAR细胞株进行培养传代,以不同浓度5-Fu作用于JAR细胞,MTT方法观察5-Fu对JAR细胞生长的抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,用逆转录聚合酶链(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)方法检测survivin基因和蛋白的表达。结果①5-Fu对JAR细胞的生长具有抑制作用,并有浓度和时间的依赖性;②5-Fu诱导JAR细胞凋亡,凋亡率随浓度而增加;③5-Fu作用后survivin基因和蛋白表达减少,随浓度增加而减少。结论5-Fu可能是通过降低survivin表达水平,诱导JAR细胞凋亡。     

DADS抑制食管胃交界部腺癌细胞OE19增殖及诱导凋亡的机制

目的探讨二烯丙基二硫化物(DADS)体外抑制食管胃交界部腺癌细胞株OE19增殖并诱导凋亡的作用及相关机制。方法 DADS处理OE19,倒置显微镜下观察细胞形态变化;MTT检测DADS对OE19细胞的增殖抑制作用;使用流式细胞术分析不同浓度DADS处理OE19后的凋亡率;Real-time PCR检测DADS对OE-19细胞Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax以及NF-κB mRNA表达水平的影响。结果作用24、48h后,DADS可以抑制OE19增殖,抑制作用呈剂量依赖性。使用40、80μg/mL的DADS处理OE19细胞24、48h,凋亡细胞比例分别为14.0%、25.4%和19.0%、27.2%。Real-time PCR检测发现DADS能够上调OE19细胞Caspase-3、Caspase-9mRNA的表达,并且能够下调NF-κB、Bcl-2mRNA的表达,且呈剂量-反应关系,Bcl-2/Bax的比值明显降低。结论 DADS在体外能够抑制食管胃交界部腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡,其凋亡机制可能是通过线粒体途径,同时NF-κB通路以及Bcl-2家族成员均参与了该过程。     

苦参碱抑制人雄激素非依赖性PC-3细胞增殖和诱导凋亡的研究

目的 研究苦参碱对人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响.方法 不同浓度苦参碱作用PC-3细胞后,应用MTT法观察苦参碱对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞仪研究苦参碱对PC-3细胞周期的影响,TUNEL法、Annexin V/PI双染分析苦参碱对PC-3细胞凋亡的影响.结果 苦参碱对PC-3细胞的生长具有抑制作用,与对照组相比有统计学差异(P<0.05).苦参碱对PC-3细胞的增殖抑制作用呈现时间及剂量依赖性关系.苦参碱的最佳药物浓度为1.0g/L,最佳作用时间为48h.流式细胞仪分析显示不同浓度苦参碱均可使PC-3细胞阻滞于G0/G1期,随着苦参碱浓度的增加,G0/G1期细胞所占的比例增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.01).TUNEL法、Annexin V/PI分析显示不同浓度苦参碱均可诱导PC-3细胞凋亡,其早期凋亡率及晚期凋亡率随着苦参碱浓度的增加而升高,呈现剂量依赖性关系(P<0.05,P<0.01).结论 苦参碱在体外可抑制PC-3细胞的增殖,具有时间和浓度依赖关系.抑制增殖和细胞周期阻滞与G0/G1期相关.苦参碱可诱导PC-3细胞凋亡,与苦参碱的作用浓度及时间有关.     

姜黄素对多巴胺诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的探讨姜黄素对多巴胺(dopamine,DA)氧化应激损伤PC12细胞(肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株)的拮抗作用的分子机制。方法以DA损伤PC12细胞为氧化应激损伤的模型,依次分成空白对照组、姜黄素组(20μmol/L)、DA组(200μmol/L)及DA(20μmol/L)+姜黄素组(200μmol/L),细胞培养24h后,采用MTT法检测细胞的增殖状况,采用Western blotting检测Bcl-2、Cyt-c及Caspase-3等蛋白的表达水平。结果①姜黄素可使DA对PC12细胞的抑制率明显下降。②姜黄素抑制DA诱导的细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调。姜黄素本身能上调细胞内Bcl-2的蛋白表达水平。③姜黄素抑制DA诱导的细胞凋亡蛋白Cyt-c表达上调。④姜黄素抑制DA上调细胞内裂解型Caspase-3蛋白的表达,但姜黄素本身对裂解型Caspase-3的表达无影响。结论姜黄素对DA氧化应激损伤PC12细胞的拮抗作用是通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调及抑制Cyt-c及Caspase-3的上调来实现的。     

全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系DU-145凋亡的分子机理

目的　克隆全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系 DU- 1 45细胞产生凋亡的相关基因。探讨维甲酸诱导前列腺癌细胞产生凋亡的分子机理。方法　应用全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系DU- 1 45细胞凋亡 ,采用基于 PCR的改良消减杂交技术克隆与凋亡相关的基因。结果　在前列腺癌 DU- 1 45细胞凋亡过程中 ,有大量肿瘤坏死因子 (TNF)的表达 ,同时 ,克隆出 c- erb B- 2基因。结论　TNF及 c- erb B- 2基因在由全反式维甲酸诱导的前列腺癌细胞系 DU- 1 45细胞凋亡过程中起着重要作用     

龙葵素通过ROS/p38信号通路诱导人前列腺癌细胞凋亡

目的探讨龙葵素对前列腺癌细胞Du145和LNCaP凋亡的分子机制。方法应用MTT法检测龙葵素对Du145和LNCaP细胞活力的影响,流式细胞术检测龙葵素对Du145和LNCaP细胞中活性氧的生成及细胞凋亡的影响,Western印迹法检测龙葵素对细胞内p38和p-p38蛋白水平的影响。结果龙葵素能显著抑制Du145和LNCaP细胞的细胞活力,且呈现剂量依赖性(P<0.01),ROS清除剂NAC能显著抑制龙葵素对细胞活力的抑制作用。40μmol/L龙葵素作用细胞24h能诱导细胞ROS生成和细胞凋亡,并促进p38磷酸化,NAC能显著抑制龙葵素诱导的细胞凋亡和p38的磷酸化,p38磷酸化抑制剂能够显著抑制龙葵素诱导的细胞凋亡。结论龙葵素诱导ROS的产生,通过激活p38通路诱导人前列腺癌细胞凋亡。