小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法　以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以人T淋巴细胞为靶抗原 ,对该库进行了 3轮淘洗 ,ELISA方法鉴定噬菌体抗体。结果　成功构建了最大实际库容量为 1 .75× 1 0 6的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库。结论　所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体。     

筛选鉴定CD44v9特异性结合肽并用于胃癌检测的研究

目的 筛选并验证CD44v9特异性多肽配体。方法 使用噬菌体展示12肽库筛选固相包被的CD44v9。测序发现待选序列,使用ELISA法进行验证,选择最佳序列合成探针。使用免疫荧光法验证C9-3多肽与CD44v过表达HEK-293细胞的结合,免疫组化法验证多肽探针与胃癌组织的特异性结合力。结果 噬菌体筛选过程中出现明确的富集效应,测序发现30个克隆包含9条序列,其中C9-3序列重复次数最高。ELISA显示9个待选序列中,C9-3序列具有最高的吸光度绝对值及选择力,因此选定为合成探针序列。C9-3探针结合于CD44v过表达HEK-293细胞,而不结合空质粒转染HEK-293细胞。C9-3探针与胃癌组织及癌旁组织结合的免疫组化评分之间存在统计学差异(t=3.953,P<0.01)。胃癌组织中,C9-3探针与CD44v9的组化评分存在线性正相关关系(r=0.823,P<0.01)。结论 本研究成功筛选出CD44v9配体多肽,可以通过CD44v9结合于细胞及胃癌组织,用于胃癌检测的探针。     

重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化

目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。     

SELEX筛选骨肉瘤HER2适配体方法的建立

目的应用SELEX(system evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选与HER2特异性结合的寡聚核酸适配体(aptamer)。方法体外合成了长度为78个碱基并含有35个随机寡核苷酸的ssDNA文库,通过生物素-链亲和素磁珠系统分离法制备次级ssDNA文库,且经以微孔为介质的SELEX正反筛法获得了与HER2特异性结合的DNA适配体;同时利用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶系统检测每轮ssDNA与靶蛋白HER2的亲和力,将亲和力最高的适配体群进行克隆、测序。最后利用生物学软件DNAMAN对适配体群进行了一级结构和二级结构的分析,同时将亲和性最高的适配体做了进一步的特异性的检验。结果经过12轮的筛选,获得了与HER2蛋白具有极高亲和力的适配体9号,亲和力从初始的0.18上升至0.86,提高了约5倍。特异性结果显示,9号适配体只与HER2具有较高的特异性。结论经过多轮的筛选,成功获得了特异性识别骨肉瘤HER2蛋白的单链DNA适配体,为骨肉瘤的诊断和治疗奠定了基础。     

迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定

目的 构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因.方法 采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出V_H和V_L可变区基因, 再通过重叠延伸拼接PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly_4ser)_3,体外构建单链抗体基因;将其克隆至表达载体pET-28a并在大肠杆菌中表达,表达产物纯化后,用SDS- PAGE、Western blot及ELASA进行鉴定.结果 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、纯化和体外复性,获得了高纯度的单链抗体片段,重组蛋白的分子质量为27 ku.ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力.结论 成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv,为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础.     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的　扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法　从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果　VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论　构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。     

抗人γ-精浆蛋白VH单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的扩增出抗人γ-精浆蛋白(γ-Sm)单克隆抗体(mAb)的重链可变区(VH)单域抗体基因,并进行原核表达及空间构象分析。方法从分泌抗γ-SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT-PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码。将其克隆到pGEX-4t-1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽(GST)亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗γ-SmVH单域抗体。竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论构建成功抗γ-Sm的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

目的 克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因,构建重组真核表达质粒,获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白.方法 应用RT-PCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RT-PCR鉴定基因转录,用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白.结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因,表达蛋白具有免疫活性.结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达.     

用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库

目的构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库。方法体外致敏并用EB病毒(EBV)转化肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。RT-PCR扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,将抗体基因分别与载体pComb3连接后,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建噬菌体呈现型Fab抗体库。结果经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生;经PCR扩增出13条轻链基因片段(κ、λ)和28条重链Fd基因片段(γ);电转化构建的噬菌体抗体库库容为1.7×107puf/mL;Fab基因的重组率约为100%。结论用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,成功构建了全人源抗肝癌Fab组合抗体文库。     

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。