THE CONSTRUCTION OF LEUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID PCDNA3/HPV16E6 AND EXPERIMENTAL OBSERVATION OF NAKED DNA INJECTED INTO ANIMAL

Cervicalcancerisacommonmalignancyofmarriedwomen.HighriskHPV(HPV16,18)infectioniscloselyassociatedwithcervicalcancer(l).HPV16DNAcanbedetectedinapproximately50%~90?rvicalcarcinomastZ).HPV16E6andE7geneshasbeenprovedtobetransforminggenes.TheirgeneproductscanbindtoandinactivateP53andPRbrespectively,playingacausalroleinthedevelopmentofcervicalcarcinomat27.AlotofinvestigationindicatethatHPV16E6/E7wereconsistentlyandhighlyexpressedincervicalcarcinomas,andthatE6/E7proteinscouldinducebothhu…     

人乳头瘤病毒16型转化基因的筛选及次级克隆

人乳头瘤病毒16型转化作用在宫颈癌发生中可能起重要作用,其转化基因主要位于基因组早期区域E6、E7开放阅读框架内。为了进一步研究HPV16转化作用,我们以Pstl+ECoRI酶解HPV16DNA,以pUC-19为载体,大肠杆菌JM103细胞为宿主菌,经两次定向次级克隆,组建了质粒pEP-8。经限制性核酸內切酶和Southem转印杂交证实,其插入片段为-1.43Kb带有E6、E7 ORF的DNA片段。在E6区上游序列还含有两个TATA盒,1个Cat盒和1个细胞特异性增强子。该质粒的组建为检测HPV感染细胞中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针,同时为进一步研究HPV转化作用及转化蛋白打下了基础。     

DETECTION OF HPV 16 E_6G ENE IN CERVICAL CANCER TISSUE

ＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＨＰＶ１６Ｅ_６ＧＥＮＥＩＮＣＥＲＶＩＣＡＬＣＡＮＣＥＲＴＩＳＳＵＥ￥ＹｕａｎＹｕｈａｎｇ（袁育康）；ＬｉｕＨａｎｘｉｎ（刘汉馨）；ＬｉｕＺｂｅｎｇｒｅｎｇ（刘正风）；ＣｈｕＹｏｎｇｌｉｅ（楚雍烈）（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉ?..     

应用PCR技术克隆人乳头瘤病毒16型E6基因

为进一步研究与宫颈癌发生密切相关的人乳头瘤病毒16型E6基因的转化作用,我们运用PCR技术扩增HPV16 E6 DNA,以pUC—19为载体,大肠杆菌了JM103为宿主菌,组建了质粒pRCE6经限制性核酸内切酶和Southern转印杂交证实,其插入片段约为0.5Kb,含有全部HPV16 E6序列。该质粒的组建为检测HPV感染中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针。同时为进一步研究HPV16 E6基因的转化作用及转化蛋白打下基础。     

用分子杂交法探讨HSV、HPV与宫颈癌的相关性

宫颈癌的流行病学特点提示癌的发生与感染因素有关。主要涉及两组病毒:单纯疱疹病毒(HSV)和人乳头瘤病毒(HPV)。为了探讨HSV、HPV 与宫颈癌的关系,我们以~(32)P 标记HSV—2DNA 和HPV DNA,分别用Southern 转印和打点杂交技术,同时检测了73例宫颈癌和14例正常宫颈活检标本。在严格状态下杂交,65例宫颈癌中未发现HSV—2DNA,其中19例癌组织RNA 与HSV—2DNA 杂交阳性。研究发现与宫颈癌组织RNA 杂交阳性的HSV—2DNA 位于0.2～0.33,0.58～0.625图谱单位。此外,在25例宫颈癌中检出了HPV_(16) DNA,2例标本检出了HPV_(18) DNA。在非严格状态下杂交,8例经PstⅠ酶切的宫颈癌组织DNA,Southern 转印后分别与HPV_(16) DNA 和HSV—2BglⅡ克隆片段杂交。结果,6例检出了HPV_(16)DNA,1例既检出了HPV_(16)DNA,又检出了HSV—2DNA。初步结果说明HPV、HSV—2与宫颈癌的发生可能有关。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

THE DETECTION OF HPV16E6，E7 GENES IN TISSUES AND THEIR ANTIBODIES IN THE SERA OF PATIENTS WITH CERVICAL CARCINOMA

ＴＨＥＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＨＰＶ１６Ｅ６，Ｅ７ＧＥＮＥＳＩＮＴＩＳＳＵＥＳ　ＡＮＤＴＨＥＩＲ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＩＮＴＨＥＳＥＲＡＯＦＰＡＴＩＥＮＴＳＷＩＴＨ　ＣＥＲＶＩＣＡＬＣＡＲＣＩＮＯＭＡＬｉｕＴｉａｎｊｕ；ＬｉｕＨｕａ；，ＳｕｎＹｉ；，Ｓ...     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的　为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法　利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果　从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论　该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。     

PRELIMINARY STUDY OF A NOVEL HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16L1／E6-E7 CHIMERIC RECOMBINANT DNA VACCINE

Objective Preparations of HPV16 L1/E6 and L1/E7 prophylactic and therapeutic DNA vaccines. Methods The nucleotides within HPV16 E6 and E7 genes, which are responsible for viral transforming activity, were mutated by mage primer site-directed mutagenesis method. The correctly mutated E6 and E7 fragments were separately cloned into an eukaryotic expression vector pVAX1, together with HPV16 L1 gene, generating chimeric recombinants plasmids 1MpVAX1-L1E6, 2MpVAX1-L1E6, 1MpVAX1-L1E7, 2MpVAX1-L1E7 and 3MpVAX1-L1E7. CHO cells were transiently transfected with the individual DNA vaccines by calcium phosphate method. Target protein expressions in the extracts of the transfected cell lines were measured by ELISA and immunohistochemistry, with HPV16 L1 and E6 specific monoclonal antibodies. Results ELISA assays showed the P/N ratios in the cell extracts transfected with L1E6 and L1E7 plasmids were more than 2.1. Immunohistochemistry revealed brownish precipitant signal in cytoplasm and nuclei of the transfected cells. Conclusion Successful constructions of prophylactic and therapeutic DNA vaccine plasmids lay solid foundation for future animal experiment and clinical trial.     

子宫颈癌患者HPV16 E6,E7血清抗体检测

通过基因工程技术制备HPV16 E6,E7抗原,用免疫酶联吸附法检测了44例子宫颈癌病人和20例健康献血员血清HPV16 E6,E7抗体。结果表明,健康人血清HPV16 E6和HPV16 E7抗体阳性者分别占35％(7/20)和20％(4/20)。病人血清中,HPV16 E6抗体阳性率68.18％(30/44),但其反应滴度均值与健康人无显著差异。HPV16 E7抗体阳性率为58.18％(25/44),其阳性率及反应滴度均明显高于健康人。这提示,HPV16 E6抗体可能并非HPV16的型特异性抗体,而HPV16 E7抗体则有可能成为子宫颈癌发生的预报信号。     

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的　分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法　采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果　成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。结论　中国人宫颈癌HPV16E6基因结构有一定的变异     

HPV-6/11 L1/E6、HPV-6/11 L1/E7嵌合DNA疫苗质粒的构建

目的　构建HPV 6 / 11L1/E6、HPV 6 / 11L1/E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法　运用PCR扩增HPV 6 /11L1、E6、E7序列 ,PCR产物连接至pGEMT Easy质粒 ,测序鉴定正确后 ,分别连接至真核表达载体pVAX ,再用酶切、连接而构建成HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX质粒。运用电穿孔法将所获得质粒转染COS 7细胞 ,免疫组化检测蛋白表达情况。结果　所构建质粒的插入目的片段测序正确 ;免疫组化检测在胞浆胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论　所构建的HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX融合蛋白表达质粒可在体外表达L1 E6 /L1 E7蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的动物实验及临床实验研究做好准备     

女性外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的相关性

目的研究外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的关系。方法收集西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的44例女性外阴病变患者的临床病理资料,包括鳞癌11例,鳞状上皮内瘤变(VIN)10例,尖锐湿疣9例及白色病变14例。采用免疫组化SP方法检测HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白的表达。结果①4组外阴病变患者年龄中位数依次为:外阴鳞癌61岁、VIN 45.5岁、尖锐湿疣24岁、外阴白色病44岁,尖锐湿疣组中位年龄低于外阴鳞癌组及白色病变组(P<0.05),其余各组间中位年龄无统计学差异。②HPV16/18E6蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组及外阴鳞癌组的阳性率分别为2/14、3/9、3/10、8/11,外阴鳞癌组高于白色病变组(P<0.05),其余各组间无统计学差异;HPV6L1蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组、外阴鳞癌组的阳性率分别为1/14、8/9、4/10、3/11,尖锐湿疣组高于其他各外阴病变组(P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义。③HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白在早期外阴鳞癌的阳性率均高于中晚期(P<0.05);HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白表达均与外阴鳞癌的组织学分级、年龄分组、绝经情况、产次不相关(P>0.05);HPV16/18E6蛋白与HPV6L1蛋白在外阴鳞癌中的表达不相关(P>0.05)。结论外阴病变的发病与年龄及HPV16/18、HPV6感染有关;外阴鳞癌中HPV16/18、HPV6的感染率与FIGO分期有关,HPV16/18感染率与HPV6的感染率无关。     

分子杂交法检测女性尖锐湿疣中的人乳头瘤病毒DNA

本研究以~(32)P标记的重组HPV 11,16,18质粒为探针,采用打点杂交法检测了60例女性尖锐湿疣组织(其中外阴47例,阴道12例、宫颈1例)中的HPVDNA;用限制性内切酶和Southern转印杂交法分析了8例HPV 11 DNA的物理状态。结果检出HPV11 19例,其中外阴13例,阴道5例,宫颈1例,阳性率31.7%;HPV16,18各1例,分别检自阴道和外阴,阳性率均为1.7%;HPV 11均以游离状态存在。这一结果为国内进一步深入研究HPV与生殖器癌之间的关系提供了资料。     

应用PCR方法检测人乳头瘤病毒的E_7转化基因

应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）检测５４份子宫颈癌活检标本中人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因的存在情况，结果显示阳性率为７２．２％（３９／５４）。ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因在人子宫颈癌组织中的高检出率，证实该转化基因与其发生关系密切。本研究同时证明，ＰＣＲ方法具有敏感、特异、快速和实用特点，值得推广。     

TDI-FP法检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16、18型别感染

目的通过模板介导的染料终止子掺入-荧光偏振技术(TDI-FP)检测宫颈癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16、18感染情况,以初步探讨本地区HPV流行特点。方法基于TDI-FP的基本原理,以HPV16、18 L1克隆重组质粒为模板,用HPV通用引物GP5+/6+PCR扩增,再通过检测探针杂交后掺入的特异荧光素标记碱基的不同来判断病毒的类型。结果在宫颈癌组织中HPV16和18型阳性率分别为61.8%及32.7%,高危型HPV占宫颈癌HPV的98.1%,宫颈癌组高危型HPV阳性率显著高于癌前病变组和慢性宫颈炎组。结论初步提示宫颈癌患者HPV感染以高危型为主,其中有超过一半的患者以HPV16型感染为主。TDI-FP是一新兴的高通量基因检测技术,快速、可靠、敏感、特异并且操作简便,更适合于大规模临床筛查及在临床上广泛推广应用。     

DIG－DNA探针检测宫颈癌组织中HPV－16的E_7转化基因

应用地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ）标记人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因作探针，分别检测了宫颈癌活检组织、宫颈炎及正常宫颈脱落细胞ＤＮＡ。其检出率为：宫颈癌中４２．１％（２４／５７）、宫颈炎中２．５％（１／３９）、正常宫颈中５．５％（１／１８）。宫颈组织中ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因的检出率较高，提示该转化基因与宫颈癌的发生可能密切相关。本研究也证实ＤＩＧ配基标记的Ｅ７基因探针具有特异、敏感、安全、稳定和能反复使用的优点，适合基层使用。     

电子阴道镜结合HPV16、18及沙眼衣原体检测对宫颈上皮内瘤样病变的诊断价值

目的　通过对电子阴道镜检查宫颈上皮内瘤样病变(CIN ),以及 HPV16、18 型、沙眼衣原体与 CIN关系的研究,探讨电子阴道镜结合HPV16、18及沙眼衣原体检测对 CIN的诊断价值。方法　采用电子阴道镜观察宫颈形态,PCR法检测宫颈组织中HPV16、18及免疫层析法检测宫颈分泌物中沙眼衣原体(CT),并与病理检查结果对照分析。结果　电子阴道镜诊断CIN的灵敏度为67%,特异度为75%,阳性预测值63%,阴性预测值78%;HPV16、18阳性病例中CIN的发生率显著高于阴性病例,电子阴道镜诊断CIN的准确率在 HPV16、18 阳性病例中显著高于阴性病例,在CT阳性与阴性病例间无显著性差异。结论　电子阴道镜适合作为CIN的诊断方法; HPV16、18 检测可作为诊断CIN的方法之一,与电子阴道镜结合可提高诊断的准确率,电子阴道镜结合CT检测对诊断CIN帮助不大。     

用聚合酶链反应检测口腔癌组织中人乳头状瘤病毒的E_6转化基因

作者采用聚合酶链反应（ＰＣＲ），并对照核酸斑点杂交法对１０例口腔恶性肿瘤组织中ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因进行了检测。这些肿瘤包括６例口腔粘膜鳞癌（ＳＣＣ），２例涎腺腺样囊性癌（ＡＣＣ），１例涎腺恶性多形性腺瘤（ＭＰＡ）和１例腭部软组织胚胎性横纹肌肉瘤（ＥＲ）。对照组为１０例非肿瘤组织，包括唇裂、腭裂粘膜组织标本各５例。结果表明两种方法检测结果基本一致，肿瘤组阳性６例（６／１０），包括４例ＳＳＣ，１例ＡＣＣ和１例ＥＲ（除外１例ＡＣＣ用核酸杂交法检测为弱阳性），其余为阴性；对照组用核酸杂交法检测４例，除１例唇裂标本为弱阳性以外，均为阴性（０／４）；用ＰＣＲ法检测１０例均为阴性结果（０／１０）。两组间ＨＰＶ１６Ｅ６转化基因的检出率有明显差异（Ｐ＜０．０５）。这一结果为开展口腔癌的ＨＰＶ病因学研究提供了参考资料。     

MAPPING EPITOPES OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16 L1 PROTEIN WITH A PHAGE DISPLAY EPITOPE LIBRARY

Theinfectionofhumanpapillomavirus(HPV)isakindofcommonsexuallytransmitteddiseases.Thehigh-riskgroupHPV,especiallyHPV16iscolselyassociatedwithhumancervicalcancer,anditwasindicatedasaninitiationfactorofcervicalcancertl].HPV16FIgenelocatedinlateopenreadingframesoftheviralgenomeencodesthemajorcoatprotein,LIprotein,whichcouldassembleintoviruslikeparticles(VLP)aloneintheinfectiousnucleit23.AbatchofevidencesshowedthattheLIproteincouldinduceantibodieswithhightiterinthehostandtheantibodiesmightp…