靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P<0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2%,蛋白表达下调68.2%(P<0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。     

二氯乙酸通过抑制HIF-1α、激活p53凋亡通路增强替莫唑胺的化疗作用

目的探讨二氯乙酸(DCA)增强替莫唑胺(TMZ)对人脑胶质瘤细胞的抑制作用及机制。方法通过体外实验,观察DCA单药、TMZ单药以及DCA/TMZ联合对人脑胶质瘤细胞的抑制作用;MTT比色法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡及细胞内活性氧(ROS)的变化;激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位(MMP);蛋白质印迹法检测细胞低氧诱导因子(HIF-1α)和p53凋亡通路相关蛋白的表达。结果 DCA/TMZ联合更有效抑制胶质瘤细胞增殖、使MMP降低、细胞内ROS增加、细胞凋亡增加;HIF-1α表达下降、p53表达升高。结论 DCA能增强TMZ对人脑胶质瘤细胞的抑制作用,其机制与抑制HIF-1α、激活p53凋亡信号通路有关。     

MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞凋亡的调控

目的研究MDM2/p53通路对多发性骨髓瘤(MM)细胞凋亡的调控作用及机制。方法体外培养人MM细胞株(RPMI 8226)并分为实验组(Nutlin-3a)和对照组(药物溶剂),采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况和抑制率,Western blot检测凋亡相关蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果与对照组相比,24、48、72 h时间点实验组细胞增殖明显降低,抑制率明显增高(P<0.05);实验组MDM2和Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),而p53的表达水平明显升高(P<0.05)。实验组各时间点凋亡率(38.42%、82.26%、82.74%)均明显高于对照组(4.80%、8.06%、14.69%)。结论 MDM2与p53之间构成降解-反式激活循环通路影响下游凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,抑制MM细胞的增殖,促进MM细胞凋亡。     

小分子RNA干扰人端粒酶逆转录酶对脑胶质瘤T98G细胞株生物学行为的影响

目的研究人端粒酶逆转录酶对胶质瘤细胞系体外生物学行为的影响,以期寻找控制胶质瘤细胞恶性行为的有效途径。方法应用小分子RNA干扰技术抑制T98G胶质瘤细胞系中端粒酶逆转录酶的表达,用MTT法、TUNEL法、Transwell分别检测T98G胶质瘤细胞中人端粒酶逆转录酶被抑制后对细胞体外增殖能力、细胞凋亡、细胞侵袭、迁移能力等生物学行为的影响。结果人端粒酶逆转录酶小分子RNA干扰片段能够有效抑制酶活性,抑制T98G胶质瘤细胞增殖(P<0.05)、诱导细胞凋亡(P<0.05)并抑制细胞的迁移与侵袭(P<0.05)。结论通过抑制人端粒酶逆转录酶的活性能够有效抑制胶质瘤细胞的体外恶性生物学行为,促进细胞凋亡。     

TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位研究

目的观察外源性三基序蛋白22(TRIM22)与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中的表达特点及共定位情况。方法分别将pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体转染U-251细胞,通过激光共聚焦显微镜观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1的表达和分布情况。通过激光共聚焦xyz轴扫描,经ImageJ 1.50i软件进行3D结构重建,观察p24-Dsred1在U-251细胞中的分布特点。将pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体在U-251细胞中共表达,观察TRIM22-EGFP和p24-DsRed1是否存在共定位关系。结果单独转染pEGFP-N3-TRIM22或pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP和p24-DsRed1在U-251细胞的胞体或突起中均有较高水平的表达;且3D结构重建显示外源性p24-DsRed1可迁移至U-251细胞的足突。在U-251细胞共转染pEGFP-N3-TRIM22和pDsRed1p24载体时,TRIM22-EGFP与p24-DsRed1存在共定位关系,并能以出胞形式脱离细胞。结论 TRIM22与HIV衣壳蛋白p24在U-251脑胶质瘤细胞中存在共定位关系。     

NT4p53(C22)Ant融合基因重组腺病毒的构建及对肝癌细胞的杀伤作用

目的构建编码融合基因NT4p53(C22)Ant嵌合肽的重组腺病毒表达载体,并研究其对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。方法使用分子克隆技术,通过同源重组获得重组腺病毒rAVV-NT4p53(C22)Ant,收集上清、大量扩增并测定其滴度。感染人肝癌HepG2细胞,采用免疫组化法检测p53表达,MTT实验、流式细胞仪观察rAAVNT4p53(C22)Ant对肿瘤细胞的杀伤作用。结果成功构建重组腺病毒表达载体,感染人肝癌HepG2细胞后p53表达率为(44.88±2.45)%;MTT检测显示,细胞存活率随作用时间延长明显降低,与空病毒组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),流式细胞仪检测显示G0/G1期细胞比例及凋亡细胞较空病毒组及对照组增加。结论构建的NT4p53(C22)Ant重组腺病毒在肝癌细胞中能有效表达,对肝癌HepG2细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。     

上调miR-181a对胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-181a对胃癌细胞增殖、周期及凋亡的影响及其作用机制。方法荧光实时定量PCR检测5种胃癌细胞及人胃黏膜细胞系GES-1中miR-181a的表达情况,以及胃癌细胞AGS瞬时转染miR-181amimic后miR-181a的表达情况;MTT法和流式细胞仪检测上调miR-181a表达对胃癌细胞AGS增殖、周期和凋亡等生物学行为的影响;Western blot检测上调miR-181a后细胞周期调控蛋白(CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21)和凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达变化。结果与人胃黏膜细胞系GES-1比较,miR-181a在人胃癌细胞株SGC-7901和MKN28表达升高(P均<0.01),在MGC-803、BGC-823、AGS表达差异无统计学意义(P均>0.05);瞬时转染miR-181amimic后,胃癌细胞AGS中miR-181a的表达明显上调(P<0.05);转染miR-181amimics后AGS细胞增殖明显,G0/G1期细胞减少,S期细胞明显增多,细胞凋亡明显减弱(P均<0.05)。Western blot结果显示,上调miR-181a后胃癌细胞AGS中CDC25A、cyclinA2和Bcl-2表达升高(P均<0.05),cyclinD1和p21表达差异没有统计学意义(P>0.05),Bax表达降低(P<0.05)。结论上调miR-181a可以促进胃癌细胞AGS增殖,其作用机制可能与CDC25A、CyclinA2表达升高有关;上调miR-181a可抑制胃癌细胞凋亡,其作用机制可能与Bcl-2表达升高及Bax表达降低有关。     

着丝粒蛋白W在脑胶质瘤中的表达及其对侵袭的作用

目的探讨着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)在人脑胶质瘤中的表达水平及与预后的相关性,并探讨其对脑胶质瘤细胞侵袭作用的影响。方法在高级别胶质瘤组织、低级别胶质瘤及瘤旁正常脑组织中,采用蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR法检测CENP-W的表达水平,并统计分析表达水平与胶质瘤临床病理特征及预后的相关性,应用特异性siRNA干扰U251细胞中CENP-W表达使其下调后,通过Transwell侵袭实验观察转染CENPW siRNA对U251细胞侵袭能力的影响。结果胶质瘤组织CENP-W表达水平明显高于正常脑组织,并且与胶质瘤的病理级别呈正相关性;转染成功后,与空白对照组及阴性对照组比较,转染CENP-W-siRNA组的细胞侵袭及迁移能力均下降,Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验显示低表达CENP-W患者的PFS明显长于高表达组。结论CENP-W表达与胶质瘤的病理级别呈正相关,CENP-W可以促进脑胶质瘤的侵袭,预示CENP-W可作为胶质瘤治疗新靶点。     

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。     

人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

目的 体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,并与其结构类似蛋白--截短型PrP(PrPΔ32-121)加以比较.方法 通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞后,观察蛋白表达及其定位情况;采用MTT实验检测转染细胞的生长状态;用流式细胞仪、Western blot等方法检测转染细胞的凋亡状态.结果 两种蛋白均可在转染细胞中表达,并存在于细胞膜上;MTT结果显示,在转染24h后均出现明显的细胞毒性作用;细胞凋亡相关实验发现,转染细胞Annexin V/PI双染阳性细胞数量增多,pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低.结论 瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用,并诱导启动细胞凋亡过程.     

CFG桩网结构地基加固处理路基变形规律研究

以武广客运专线典型路基断面为例,对路基沉降变形进行监测,结合实测沉降曲线对沉降规律进行探索,并利用曲线拟合法对路基沉降进行预测.预测结果表明:CFG桩复合地基剩余沉降最大值5.6 mm;双曲线法预测的沉降曲线与实测数据比较接近;路基的工后沉降与填土高度存在一定的相关性.     

主动铰接系统在盾构姿态调整中的应用

介绍ROBBINS公司生产的EPB6260盾构机主动铰接系统的结构和工作原理以及在盾构施工过程中管片选型原则、方法,详细阐述了盾构机与管片姿态调整的具体方法和科学依据,以及姿态调整对工程质量的重要性.通过姿态调整,盾构施工安全平稳,盾构姿态良好,通过提前预知下儿环管片,盾构施工效率明显提高.此种方法的使用对隧道施工和设...     

沈阳地铁中粗砂地层中盾构机刀具配置及刀盘结构分析

沈阳市工程地质以中粗砂地层为主,目前使用的个别盾构机刀具配置与该地区地质条件不甚适应,导致了刀具、刀盘异常磨损。根据地铁一号线云沈区间盾构施工的实际经验,介绍了中粗砂地层中盾构机刀具选型、刀盘结构设计、先行撕裂刀与刮刀的相对位置、添加剂注入孔和搅拌棒的布置等刀具配置要注意的因素。对类似地质条件盾构机刀具配置及刀盘结构设...     

路基压实质量连续同步检测可行性试验研究

目前路基压实质量检测的方法存在诸多不足,提出了以振动轮动力响应为基础的连续测试路基压实状态的检测方法,并在中铁一局哈大客运专线路基上进行了对比试验研究,验证了连续压实质量控制指标δCMV与目前客运专线路基压实质量力学检测指标K30、EV2具有很好的相关性。表明在获得更多的试验数据后,可以考虑采用连续压实质量控制指标对路基压实施工进行过程控制,减少目前的检测工作量。     

构建物流法律体系的思考

物流业的发展需要制订统一的物流发展规划、技术标准和《物流法》及与之配套的法律法规，形成完整的物流法律体系。并应明确物流行业主体的资质、权利义务和法律责任，以促进我国物流业的健康发展。     

TBM主轴承润滑系统污染成因分析

隧道掘进机（以下简称TBM）液压系统庞杂,用于润滑和传动的工作介质均为油或脂,因此,加强油液的状态监测对TBM的维护保养尤为重要。主轴承是掘进机的最关键部件,价格昂贵,及时、有效地对其润滑系统进行监测,可有助于了解和掌握机器的运行状况,确定并排除故障,从而提高TBM的使用效率,降低不必要的经济损失和工程风险。     

沪通长江大桥施工期对桥区河床演变影响分析

为研究大型跨江桥梁工程建设后对桥区河床响应的影响,以沪通长江大桥为例,进行大桥建设期间桥区河床地形、汊道分流比监测,对比分析工程建设前后桥区汊道分流比、桥区河床平面、断面、冲淤变化特征,掌握大桥工程建设后的桥区水动力、大型沉井基础局部冲刷、桥区深槽响应的影响特点,并与前期模型研究成果进行对比分析,为大桥工程顺利建设和工程河段跨江桥梁建设提供科学依据.分析结果表明,大桥施工期间天生港水道桥墩基础局部冲刷及深槽冲刷幅度2～3 m;浏海沙水道28#、29#主墩基础及深槽冲刷幅度较大,深槽断面普遍冲刷4～5 m,主墩28#、29#基础局部冲深28.1 m、19.1 m.大桥施工期间对桥轴线断面流速分布影响较小,桥区汊道分流比基本稳定,对桥区河势稳定影响较小.     

青藏铁路冻土沼泽化斜坡湿地路基稳定性研究

结合青藏铁路安多段冻土路基的设计与施工,从地基斜坡、地基强度、地表水和温度场四方面分析了影响沼泽化斜坡湿地冻土路基稳定性的因素,提出了设计和施工过程中需要采取的保证路基稳定性的技术措施,例如在路基下部设置1m厚的片石层、路基体内设置双向土工格栅、在路基上游设置隔水板和挡水堤等;在此基础上对安多段沼泽化斜坡湿地冻土路基的水平位移进行了长期监测,监测表明路基稳定,为类似工程的设计和施工提供了参考依据。     

浅析虚测设圆曲线半径确定法

本文在论述传统教材中虚交圆曲线测设同时，着重讨论了虚交中圆曲线位于基线内、外侧的临界半径值的确定，以及如何通过有利地点确定理想的曲线半径，同时给出相应的计算公式。     

区间上帐篷类映射的强混合性

本文证明了帐篷类映射相对于Ｌｅｂｅｓｇｕｅ测度而言是强混合的。