人乳头瘤病毒16型转化基因的筛选及次级克隆

人乳头瘤病毒16型转化作用在宫颈癌发生中可能起重要作用,其转化基因主要位于基因组早期区域E6、E7开放阅读框架内。为了进一步研究HPV16转化作用,我们以Pstl+ECoRI酶解HPV16DNA,以pUC-19为载体,大肠杆菌JM103细胞为宿主菌,经两次定向次级克隆,组建了质粒pEP-8。经限制性核酸內切酶和Southem转印杂交证实,其插入片段为-1.43Kb带有E6、E7 ORF的DNA片段。在E6区上游序列还含有两个TATA盒,1个Cat盒和1个细胞特异性增强子。该质粒的组建为检测HPV感染细胞中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针,同时为进一步研究HPV转化作用及转化蛋白打下了基础。     

宫颈癌患者人乳头瘤病毒16型E6基因的克隆及序列分析

目的　分析中国陕西地区宫颈癌患者人乳头瘤病毒 16型 (HPV16型 )E6基因的结构特点。方法　采用PCR技术扩增了 1例HPV16阳性宫颈癌患者癌组织中HPV16E6基因 ,并对其进行了克隆及全序列分析。结果　成功地克隆了HPV16E6基因 ,与GenBank收录的原型相比 ,E6基因中有 2个碱基发生突变 ,推导其编码的氨基酸有 1个发生了变化。结论　中国人宫颈癌HPV16E6基因结构有一定的变异     

人类乳头瘤病毒16型早期基因178位(T→G)突变分析

目的检测宫颈癌患者高危型人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型阳性标本中早期基因(E6基因)178位(T→G)点突变情况。方法应用模板指导的染料终止子掺入-荧光偏振检测技术(TDI-FP)方法检测宫颈癌患者高危HPV16型E6基因178位点突变情况,以进一步明确此基因位点突变与宫颈癌变的相关性。结果应用TDI-FP法检测宫颈癌组织中高危HPV16型E6基因178位突变率为32.5%,与癌前病变及慢性宫颈炎患者相比,差异具有统计学意义(χ2=20.623,P<0.01)。结论宫颈癌患者HPV16型E6基因178位(T→G)突变率较高,可能是HPV致癌的一个高危因素。     

子宫颈癌患者HPV16 E6,E7血清抗体检测

通过基因工程技术制备HPV16 E6,E7抗原,用免疫酶联吸附法检测了44例子宫颈癌病人和20例健康献血员血清HPV16 E6,E7抗体。结果表明,健康人血清HPV16 E6和HPV16 E7抗体阳性者分别占35％(7/20)和20％(4/20)。病人血清中,HPV16 E6抗体阳性率68.18％(30/44),但其反应滴度均值与健康人无显著差异。HPV16 E7抗体阳性率为58.18％(25/44),其阳性率及反应滴度均明显高于健康人。这提示,HPV16 E6抗体可能并非HPV16的型特异性抗体,而HPV16 E7抗体则有可能成为子宫颈癌发生的预报信号。     

HPV-6/11 L1/E6、HPV-6/11 L1/E7嵌合DNA疫苗质粒的构建

目的　构建HPV 6 / 11L1/E6、HPV 6 / 11L1/E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法　运用PCR扩增HPV 6 /11L1、E6、E7序列 ,PCR产物连接至pGEMT Easy质粒 ,测序鉴定正确后 ,分别连接至真核表达载体pVAX ,再用酶切、连接而构建成HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX质粒。运用电穿孔法将所获得质粒转染COS 7细胞 ,免疫组化检测蛋白表达情况。结果　所构建质粒的插入目的片段测序正确 ;免疫组化检测在胞浆胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论　所构建的HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX融合蛋白表达质粒可在体外表达L1 E6 /L1 E7蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的动物实验及临床实验研究做好准备     

子宫颈癌患者组织HPV16 E_6、E_7基因及其血清抗体检测

用多聚酶链反应检测子宫颈癌组织HPV16E6、E7基因，同时用基因工程方法制备E6、E7抗原，以免疫酶联吸附法检测其血清抗体。结果表明，宫颈癌组织中HPV16E6、E7DNA检出总阳性率为71．8％，E6、E7基因检出率分别为37．5％（12／32）和65．6％（21／32）。HPV16E6、E7血清抗体反应     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的　为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法　利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果　从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论　该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。     

子宫颈癌患者组织HPV16 E_6、E_7基因及其血清抗体检测

用多聚酶链反应检测子宫颈癌组织HPV16E6、E7基因，同时用基因工程方法制备E6、E7抗原，以免疫酶联吸附法检测其血清抗体。结果表明，宫颈癌组织中HPV16E6、E7DNA检出总阳性率为71．8％，E6、E7基因检出率分别为37．5％（12／32）和65．6％（21／32）。HPV16E6、E7血清抗体反应阳性率为68．18％（30／44）和56．18％（25／44）。结果同时显示HPV16E6、E7DNA分布并不均一，存在E 6、E 7、E 6E 7和E6-E-74种模式，并且其血清抗体反应和DNA存在情况也不一致，E6抗体阳性的24例患者中，仅9例可检出其DNA，E，同样如此。这些似…     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

人子宫颈癌中的HPV_(16)E_6mRNA、p~(53)、P~(21)~(ras)和c-myc蛋白表达

为进一步探讨子宫颈癌的分子发病机制，采用PCR、ISH和IHC方法对51例子宫颈癌组织的HPV16感染、HPV16E6mRNA、p53、p21ras和c－myc蛋白表达分布进行了研究。结果表明51例中有HPV16感染者38例，HPV16E6mRNA表达者35例，其阳性细胞主要分布在高分化癌巢之周边部或中、低分化癌之整个癌巢；p53、p21ras和c－myc蛋白阳性检出率分别为33．3％、60．8％和76．5％，其阳性细胞是弥漫或灶状分布。统计分析表明HPV16感染与P53、P21ras、c－myc蛋白积累间无关，但后三者间则显著相关。这提示癌基因活化或抗癌基因的失活及HPV16感染等因素之协同在子宫颈癌的发生发展中起重要作用。     

THE CONSTRUCTION OF LEUKARYOTIC EXPRESSION PLASMID PCDNA3/HPV16E6 AND EXPERIMENTAL OBSERVATION OF NAKED DNA INJECTED INTO ANIMAL

Cervicalcancerisacommonmalignancyofmarriedwomen.HighriskHPV(HPV16,18)infectioniscloselyassociatedwithcervicalcancer(l).HPV16DNAcanbedetectedinapproximately50%~90?rvicalcarcinomastZ).HPV16E6andE7geneshasbeenprovedtobetransforminggenes.TheirgeneproductscanbindtoandinactivateP53andPRbrespectively,playingacausalroleinthedevelopmentofcervicalcarcinomat27.AlotofinvestigationindicatethatHPV16E6/E7wereconsistentlyandhighlyexpressedincervicalcarcinomas,andthatE6/E7proteinscouldinducebothhu…     

DETECTION OF HPV 16 E_6G ENE IN CERVICAL CANCER TISSUE

ＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＨＰＶ１６Ｅ_６ＧＥＮＥＩＮＣＥＲＶＩＣＡＬＣＡＮＣＥＲＴＩＳＳＵＥ￥ＹｕａｎＹｕｈａｎｇ（袁育康）；ＬｉｕＨａｎｘｉｎ（刘汉馨）；ＬｉｕＺｂｅｎｇｒｅｎｇ（刘正风）；ＣｈｕＹｏｎｇｌｉｅ（楚雍烈）（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉ?..     

THE DETECTION OF HPV16E6，E7 GENES IN TISSUES AND THEIR ANTIBODIES IN THE SERA OF PATIENTS WITH CERVICAL CARCINOMA

ＴＨＥＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＨＰＶ１６Ｅ６，Ｅ７ＧＥＮＥＳＩＮＴＩＳＳＵＥＳ　ＡＮＤＴＨＥＩＲ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＩＮＴＨＥＳＥＲＡＯＦＰＡＴＩＥＮＴＳＷＩＴＨ　ＣＥＲＶＩＣＡＬＣＡＲＣＩＮＯＭＡＬｉｕＴｉａｎｊｕ；ＬｉｕＨｕａ；，ＳｕｎＹｉ；，Ｓ...     

女性外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的相关性

目的研究外阴病变及其与HPV16/18、HPV6的关系。方法收集西安交通大学医学院第二附属医院手术治疗的44例女性外阴病变患者的临床病理资料,包括鳞癌11例,鳞状上皮内瘤变(VIN)10例,尖锐湿疣9例及白色病变14例。采用免疫组化SP方法检测HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白的表达。结果①4组外阴病变患者年龄中位数依次为:外阴鳞癌61岁、VIN 45.5岁、尖锐湿疣24岁、外阴白色病44岁,尖锐湿疣组中位年龄低于外阴鳞癌组及白色病变组(P<0.05),其余各组间中位年龄无统计学差异。②HPV16/18E6蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组及外阴鳞癌组的阳性率分别为2/14、3/9、3/10、8/11,外阴鳞癌组高于白色病变组(P<0.05),其余各组间无统计学差异;HPV6L1蛋白在外阴白色病变组、尖锐湿疣组、VIN组、外阴鳞癌组的阳性率分别为1/14、8/9、4/10、3/11,尖锐湿疣组高于其他各外阴病变组(P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义。③HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白在早期外阴鳞癌的阳性率均高于中晚期(P<0.05);HPV16/18E6蛋白、HPV6L1蛋白表达均与外阴鳞癌的组织学分级、年龄分组、绝经情况、产次不相关(P>0.05);HPV16/18E6蛋白与HPV6L1蛋白在外阴鳞癌中的表达不相关(P>0.05)。结论外阴病变的发病与年龄及HPV16/18、HPV6感染有关;外阴鳞癌中HPV16/18、HPV6的感染率与FIGO分期有关,HPV16/18感染率与HPV6的感染率无关。     

PRELIMINARY STUDY OF A NOVEL HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16L1／E6-E7 CHIMERIC RECOMBINANT DNA VACCINE

Objective Preparations of HPV16 L1/E6 and L1/E7 prophylactic and therapeutic DNA vaccines. Methods The nucleotides within HPV16 E6 and E7 genes, which are responsible for viral transforming activity, were mutated by mage primer site-directed mutagenesis method. The correctly mutated E6 and E7 fragments were separately cloned into an eukaryotic expression vector pVAX1, together with HPV16 L1 gene, generating chimeric recombinants plasmids 1MpVAX1-L1E6, 2MpVAX1-L1E6, 1MpVAX1-L1E7, 2MpVAX1-L1E7 and 3MpVAX1-L1E7. CHO cells were transiently transfected with the individual DNA vaccines by calcium phosphate method. Target protein expressions in the extracts of the transfected cell lines were measured by ELISA and immunohistochemistry, with HPV16 L1 and E6 specific monoclonal antibodies. Results ELISA assays showed the P/N ratios in the cell extracts transfected with L1E6 and L1E7 plasmids were more than 2.1. Immunohistochemistry revealed brownish precipitant signal in cytoplasm and nuclei of the transfected cells. Conclusion Successful constructions of prophylactic and therapeutic DNA vaccine plasmids lay solid foundation for future animal experiment and clinical trial.     

CLONING OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 GENOME FROM CERVICAL CANCER TISSUE

Humanpapillomavirus(HPV)caninducemanybenignproliferateddiseases,forexample,lowergenitalwartsandhasacloserelationshipwithcervicalcancer.Morethan70typesofHPVhavebeenclonedandidentifiedc1J.MostofthemwereclonedintoplasmidPBR322.SinceHPVcannotproliferateinanycellcultureinvitroasyetmostHPVDNAsusedinChinacomefromabroad.InordertoconstructourHPVDNAclone,theHPV-16DNAwasisolatedfromthecervicalcancertissueandclonedasfollows.MATERIALSANDMETHODS1SpecimencollectionandtissueDNAextraction…