相关蛋白在携带载脂蛋白-J基因大鼠BMSCs中的表达及意义

目的检测重组质粒pEGFP-N1-apoJ在不同量、不同时间条件下转染大鼠骨髓间充质干细胞的瞬时转染效率,并测定载脂蛋白-J(ApoJ)在靶细胞中能否高表达。方法贴壁培养细胞,并用脂质体LipofectaminTM2000分别介导0.8、1.2、1.6、2.0μg重组质粒pEGFP-N1-apoJ转染,置荧光显微镜下观察转染结果,测定在24、48、72h时间点的瞬时转染效率。蛋白免疫印迹法分别检测pEGFP-N1-apoJ质粒转染组、空pEGFP-N1质粒转染组、空白对照组ApoJ的表达情况。结果不同的质粒量中1.6μg pEGFP-N1-apoJ质粒与3.0μL脂质体制备的复合物瞬时转染效率最高,分别作用24、48、72h可达27.8%、34.3%、28.2%。蛋白免疫印迹法检测到pEGFP-N1-apoJ质粒组大量ApoJ表达,空质粒及空白对照组见微量ApoJ表达;并且pEGFP-N1-apoJ质粒组Apo-J的表达明显高于空载体及空白对照组(P<0.05)。结论利用脂质体介导可将重组质粒pEGFP-N1-apoJ成功转染入大鼠骨髓间充质干细胞,ApoJ在大鼠骨髓间充质干细胞中得到大量表达。     

脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.     

重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力。     

中国人丙型肝炎病毒复合细胞毒性T淋巴细胞多表位基因真核载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复合细胞毒性T淋巴细胞(CTL)多表位基因的真核表达载体,并观察其在真核细胞中的表达.方法 根据生物信息学方法筛选中国人的HCV多个CTL优势表位,合成复合多表位抗原基因(mcf);将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1,转染COS-7细胞,在荧光显微镜下观察mcf-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位,RT-PCR及Western blot检测其mRNA及蛋白表达.结果 成功构建了真核表达载体pEGFP-mcf.将构建的真核表达载体pEGFP-mcf转染 COS-7细胞后,绿色荧光分布于COS-7细胞胞质中;而转染空载体pEGFP-N1后,绿色荧光弥散分布于COS-7细胞胞核及胞质中.RT-PCR检测到转染细胞中mcf mRNA表达;Western blot结果证明合成mcf可在COS-7细胞中表达.结论 该真核表达载体的成功表达及鉴定,为下一步中国人的HCV复合CTL多表位疫苗的研究奠定了基础.     

着丝粒蛋白W在脑胶质瘤中的表达及其对侵袭的作用

目的探讨着丝粒蛋白W(centromere protein W,CENP-W)在人脑胶质瘤中的表达水平及与预后的相关性,并探讨其对脑胶质瘤细胞侵袭作用的影响。方法在高级别胶质瘤组织、低级别胶质瘤及瘤旁正常脑组织中,采用蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR法检测CENP-W的表达水平,并统计分析表达水平与胶质瘤临床病理特征及预后的相关性,应用特异性siRNA干扰U251细胞中CENP-W表达使其下调后,通过Transwell侵袭实验观察转染CENPW siRNA对U251细胞侵袭能力的影响。结果胶质瘤组织CENP-W表达水平明显高于正常脑组织,并且与胶质瘤的病理级别呈正相关性;转染成功后,与空白对照组及阴性对照组比较,转染CENP-W-siRNA组的细胞侵袭及迁移能力均下降,Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验显示低表达CENP-W患者的PFS明显长于高表达组。结论CENP-W表达与胶质瘤的病理级别呈正相关,CENP-W可以促进脑胶质瘤的侵袭,预示CENP-W可作为胶质瘤治疗新靶点。     

靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P<0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2%,蛋白表达下调68.2%(P<0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。     

人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

目的 体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,并与其结构类似蛋白--截短型PrP(PrPΔ32-121)加以比较.方法 通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞后,观察蛋白表达及其定位情况;采用MTT实验检测转染细胞的生长状态;用流式细胞仪、Western blot等方法检测转染细胞的凋亡状态.结果 两种蛋白均可在转染细胞中表达,并存在于细胞膜上;MTT结果显示,在转染24h后均出现明显的细胞毒性作用;细胞凋亡相关实验发现,转染细胞Annexin V/PI双染阳性细胞数量增多,pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低.结论 瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用,并诱导启动细胞凋亡过程.     

阳离子聚合物介导的体外培养兔角膜内皮细胞基因转移

目的观察非病毒载体阳离子聚合物(SofastTM)介导的编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pEGFP-N1和pIRE-EGFP两种质粒对体外培养的兔角膜内皮细胞(RCEC)的转染效率和转染前后细胞Na+-K+-ATPase活性变化,探索最优的体外RCEC非病毒载体基因转移条件。方法消化法原代培养RCEC,SofastTM与pEGFP-N1和pIRE-EGFP两种质粒按不同比例混合,介导此两种质粒转染RCEC,分别比较各质粒不同时间的转染效率,并检测转染与未转染细胞Na+-K+-ATPase的活性以确定基因转移对RCEC活性的影响。结果SofastTM与质粒(pEGFP-N1和pIRE-EGFP)按不同比例转染RCEC后,24-48 h均有EGFP的表达。SofastTM∶pEGFP-N1=3.2∶1组在转染后48 h时转染效率最高(P<0.05),为3.6%。SofastTM∶pIRE-EGFP=3.2∶1组在转染后24 h时转染效率最高(P<0.05),为3.5%。转染与未转染组细胞数和细胞Na+-K+-ATPase活性均无明显差异。结论SofastTM可有效介导以pEG-FP-N1和pIRE-EGFP为载体的外源基因向体外培养的RCEC转移,且基因转移后RCEC活性不受影响。     

二氯乙酸通过抑制HIF-1α、激活p53凋亡通路增强替莫唑胺的化疗作用

目的探讨二氯乙酸(DCA)增强替莫唑胺(TMZ)对人脑胶质瘤细胞的抑制作用及机制。方法通过体外实验,观察DCA单药、TMZ单药以及DCA/TMZ联合对人脑胶质瘤细胞的抑制作用;MTT比色法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡及细胞内活性氧(ROS)的变化;激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位(MMP);蛋白质印迹法检测细胞低氧诱导因子(HIF-1α)和p53凋亡通路相关蛋白的表达。结果 DCA/TMZ联合更有效抑制胶质瘤细胞增殖、使MMP降低、细胞内ROS增加、细胞凋亡增加;HIF-1α表达下降、p53表达升高。结论 DCA能增强TMZ对人脑胶质瘤细胞的抑制作用,其机制与抑制HIF-1α、激活p53凋亡信号通路有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率。方法应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs,贴壁法不断纯化,流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达,然后用pEGFP-N3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率。结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形,有聚集生长的倾向,多3~5个细胞成为一个集落。传代后,细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样,长梭形,胞浆突起较少,胞体轮廓不甚清晰,胞体也相对较大;②GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达最强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达;③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关,1∶2到1∶3最高。结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;GFP转染是一种较好的MSCs标记方法。     

文艺与道德

文艺与道德，是分属于两门不同学科的基本概念，研究文艺与道德之间的关系。对于促进精神文明建设有一定的价值。     

和谐社会与高校思想政治工作

构建社会主义和谐社会,是我们党全面贯彻落实科学发展观,从中国特色社会主义事业总体布局和全面建设小康社会全局出发提出的重大战略任务.高校是构建社会主义和谐社会的重要阵地,思想政治工作犹为重要.     

实验检测与质量控制

公路工程施工主要包括质量、进度、费用三大控制目标,工程质量是公路建设的关键,而搞好质量控制离不开科学的管理和试验手段,近年来检测实践表明：“用数据说话、以理服人”是检测工作的一条基本原则,借助试验手段是实现施工质量有效途径之一。但从近年来的试验检测现状来看,仍差强人意,试验检测仍存在一些亟待解决的问题。从试验检测影响工程质量的角度笔者认为应该从以下几个方面入手。     

东南亚国家《道路与桥梁设计施工标准和规范》与中国公路规范的有关差异

东南亚中南半岛国家 (越南、 老挝、 柬埔寨、 泰国、 缅甸) 为促进跨国界运输和中国一起制定了该区域范围内道路和桥梁的设计施工标准和规范, 本文着重介绍了该标准和我国现有标准技术指标的主要差别, 通过对路线技术指标等对比提出两者存在的差异, 为我国的设计单位提供参考。 总体上来说该标准和规范主要借鉴了中国的规范和美国的标准, 同时结合中南半岛区域的地形条件作了适当的降低。     

高速公路桥涵养护管理中存在的问题及对策

高速公路桥涵的养护和管理存在较多问题,会造成一定安全隐患.加强高速公路桥涵的养护管理工作很重要和必要.针对高速公路桥涵工程后期养护工作的不足进行分析,提出防治方面的措施和建议,可供桥涵养护工作参考.     

“现代”时尚,尊贵典雅——厦门金旅与韩国现代开启金色合作之路

这是所有参加2009年厦门金旅新品巡展活动的各界朋友对XML6700金旅现代底盘考斯特的共识.历经了十余年市场的检验,金旅考斯特以其优良的内在品质始终屹立同行前列,赢得各界赞誉.在同类产品越来越多,市场竞争日趋激烈的今天,金旅人认为产品达到一定高度之后,只有不满于现状、进一步提升自身品质,才能在未来市场竞争中处于领先地位.     

科学发展与公路勘察设计

落实科学发展观,提高公路勘察设计水平,才能实现公路建设新的跨越式发展。     

文化的流变和兼容与文学翻译

本指出了化的流变和兼容是学翻译面临的化的两种本质属性,讨论了化的流变对学翻译的创造性意义,学翻译对语言变体的创新与还原,是克服流变造成的理解困难的前提条件。译对原本的解构与重构也是化流变中的翻译创新。作从本的互性和译的心态角度,分析了学翻译同化兼容的互动关系。指出化的流变和兼容必然导致误译,而误译也会对跨化的学交流产生积极影响。     

《梁山伯与祝英台》和《罗密欧与朱丽叶》之比较

尽管《梁山伯与祝英台》和《罗密欧与朱丽叶》两部作品在追求爱情,主要情节和人物塑造等方面相近,但在人物形象,悲剧意义和悲剧结局等方面又各具特色。     

公路桥涵勘测设计中的常见问题及其对策

在公路桥涵勘测设计理念中,主体思想是将排水系统、行车机制以及通航体系融入到桥涵建设中.针对实施桥涵勘测工作中通常会遇到的桥涵水毁、土质松软等不利因素,提出一套合理化勘测策略和勘测管理机制的改进建议,以优化勘测技术、推动桥涵勘测工作的有序发展.