用分子杂交法检测妇女宫颈疾患中的HPVDNA

为了探讨人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）与宫颈癌之间的相关性，我们收集了全国宫颈癌高发县之一的略阳县１２例宫颈癌，１２例宫颈间变，３６例宫颈Ⅱ～Ⅲ度糜烂患者的组织标本，经抽提ＤＮＡ以后，以［ａ－３２Ｐ］ｄＡＴＰ标记ＨＰＶ１６、１８型ＤＮＡ进行打点杂交。结果为宫颈癌ＨＰＶ１６阳性６例，ＨＰＶ１８阳性１例。宫颈间变ＨＰＶ１６阳性４例，ＨＰＶ１８阳性１例。ＨＰＶ１６阳性率分别为５０％和３３．３％，ＨＰＶ１８阳性率为８．３％。宫颈糜烂Ⅱ～Ⅲ度的患者组织ＤＮＡ与ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８混合杂交阳性１７例，阳性率为４７．２％。     

羊瘙痒因子263K经灌胃感染仓鼠动物模型的建立

目的　胃肠感染是大多数动物类传染性海绵状脑病(TSE)传播的最主要途径。建立羊瘙痒因子263K灌胃感染仓鼠动物模型,并研究其发病特征。方法　Scrapie 263K毒株低剂量和高剂量经灌胃途径接种金黄仓鼠,在终末期取脑组织,用HE染色观察病理变化,免疫组化法检测PrPSc 的组织沉积特点, Western blot 检测PrPSc 分子特征。结果　低剂量灌胃组仅一只动物发病,高剂量组所有接种动物均发病,潜伏期较颅内注射组明显延长。在脑组织中观察到典型的病理改变;PrPSc免疫组化检测显示弥漫性沉积于脑组织,主要累及脑干、大脑皮层深层、小脑,基本与病理学改变累及的区域一致;Western Blot检测发现感染动物脑提取物出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带,与颅内注射组脑组织提取物中PrPSc电泳性状完全一致。结论　羊瘙痒因子263K灌胃可成功引起动物发病,与颅内注射比较,潜伏期、神经病理变化和PrPsc沉积均有不同,可能受到感染途径的影响。     

人乳头瘤病毒16型转化基因的筛选及次级克隆

人乳头瘤病毒16型转化作用在宫颈癌发生中可能起重要作用,其转化基因主要位于基因组早期区域E6、E7开放阅读框架内。为了进一步研究HPV16转化作用,我们以Pstl+ECoRI酶解HPV16DNA,以pUC-19为载体,大肠杆菌JM103细胞为宿主菌,经两次定向次级克隆,组建了质粒pEP-8。经限制性核酸內切酶和Southem转印杂交证实,其插入片段为-1.43Kb带有E6、E7 ORF的DNA片段。在E6区上游序列还含有两个TATA盒,1个Cat盒和1个细胞特异性增强子。该质粒的组建为检测HPV感染细胞中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针,同时为进一步研究HPV转化作用及转化蛋白打下了基础。     

PRELIMINARY STUDY OF A NOVEL HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 16L1／E6-E7 CHIMERIC RECOMBINANT DNA VACCINE

Objective Preparations of HPV16 L1/E6 and L1/E7 prophylactic and therapeutic DNA vaccines. Methods The nucleotides within HPV16 E6 and E7 genes, which are responsible for viral transforming activity, were mutated by mage primer site-directed mutagenesis method. The correctly mutated E6 and E7 fragments were separately cloned into an eukaryotic expression vector pVAX1, together with HPV16 L1 gene, generating chimeric recombinants plasmids 1MpVAX1-L1E6, 2MpVAX1-L1E6, 1MpVAX1-L1E7, 2MpVAX1-L1E7 and 3MpVAX1-L1E7. CHO cells were transiently transfected with the individual DNA vaccines by calcium phosphate method. Target protein expressions in the extracts of the transfected cell lines were measured by ELISA and immunohistochemistry, with HPV16 L1 and E6 specific monoclonal antibodies. Results ELISA assays showed the P/N ratios in the cell extracts transfected with L1E6 and L1E7 plasmids were more than 2.1. Immunohistochemistry revealed brownish precipitant signal in cytoplasm and nuclei of the transfected cells. Conclusion Successful constructions of prophylactic and therapeutic DNA vaccine plasmids lay solid foundation for future animal experiment and clinical trial.     

人doppel蛋白及其类似蛋白PrPΔ32-121对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

目的 体外观察细胞瞬时表达的人Dpl(doppel)蛋白对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用,并与其结构类似蛋白--截短型PrP(PrPΔ32-121)加以比较.方法 通过PCR方法获得人PRND基因及截短型PRNP基因并克隆至真核表达载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞后,观察蛋白表达及其定位情况;采用MTT实验检测转染细胞的生长状态;用流式细胞仪、Western blot等方法检测转染细胞的凋亡状态.结果 两种蛋白均可在转染细胞中表达,并存在于细胞膜上;MTT结果显示,在转染24h后均出现明显的细胞毒性作用;细胞凋亡相关实验发现,转染细胞Annexin V/PI双染阳性细胞数量增多,pro-casepase-3和Bcl-2因子水平降低.结论 瞬时表达的Dpl蛋白与截短型PrP可产生类似的神经细胞毒性作用,并诱导启动细胞凋亡过程.     

尖锐湿疣中人乳头瘤病毒DNA检测及存在情况初探

尖锐湿疣的发病与人乳头瘤病毒密切相关。本文用打点杂交法检测了28例尖锐湿疣病理标本,其中14例与HPV-11探针杂交阳性,阳性率50%(14/28)。对其中杂交信号较强的9例进一步分别用BamI Ⅱ、PstI酶解,Southem转印后与HPV-11探针杂交,对病毒DNA存在形式进行分析,结果证实HPV-11在尖锐湿疣细胞中主要以游离形式存在。     

分子杂交法检测女性尖锐湿疣中的人乳头瘤病毒DNA

本研究以~(32)P标记的重组HPV 11,16,18质粒为探针,采用打点杂交法检测了60例女性尖锐湿疣组织(其中外阴47例,阴道12例、宫颈1例)中的HPVDNA;用限制性内切酶和Southern转印杂交法分析了8例HPV 11 DNA的物理状态。结果检出HPV11 19例,其中外阴13例,阴道5例,宫颈1例,阳性率31.7%;HPV16,18各1例,分别检自阴道和外阴,阳性率均为1.7%;HPV 11均以游离状态存在。这一结果为国内进一步深入研究HPV与生殖器癌之间的关系提供了资料。     

CLONING OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 GENOME FROM CERVICAL CANCER TISSUE

Humanpapillomavirus(HPV)caninducemanybenignproliferateddiseases,forexample,lowergenitalwartsandhasacloserelationshipwithcervicalcancer.Morethan70typesofHPVhavebeenclonedandidentifiedc1J.MostofthemwereclonedintoplasmidPBR322.SinceHPVcannotproliferateinanycellcultureinvitroasyetmostHPVDNAsusedinChinacomefromabroad.InordertoconstructourHPVDNAclone,theHPV-16DNAwasisolatedfromthecervicalcancertissueandclonedasfollows.MATERIALSANDMETHODS1SpecimencollectionandtissueDNAextraction…