抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体/人p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析

目的　构建抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)重链可变区 (VH)单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,并进行空间构象分析。方法　选用人IgG3上游铰链区作为抗体和人p5 3四价功能域之间连接的linker。利用回归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四价功能域融合基因 ,并在融合基因 5’端和 3’端引入SalⅠ与HindⅢ酶切位点 ,将融合基因克隆入 pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3 /p5 3克隆载体。将抗人γ SmVH 单域抗体克隆入 pUC1 9/IgG3 /p5 3载体中 ,构建抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后 ,利用计算机软件进行空间构象分析。结果　获得了抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,基因全长 5 2 8bp ,可编码 1 76个氨基酸 ,与已发表的抗人γ SmVH 单域抗体、人IgG3上游铰链区和人p5 3四价功能域基因cDNA序列一致。计算机软件分析结果显示 ,融合基因表达产物可自动装配成四聚体抗体 ,并具有四条长的、柔性好的多肽 ,可确保每个抗体空间构象的独立性。结论　构建成功四价抗人γ SmVH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。     

人羧肽酶A1的毕赤酵母可溶表达

目的应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidase A1,CPA1)蛋白。方法从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达。结果构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1蛋白。结论在毕赤酵母中成功表达了CPA1,为进一步研究CPA1在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用奠定了基础。     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的　扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法　从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果　VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论　构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。