酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白

目的应用酵母双杂交技术研究筛选与人类PIF1解螺旋酶相互作用的蛋白。方法应用酵母双杂交技术,以人PIF1蛋白PINT功能域(1¹80氨基酸)和解螺旋酶模序(167180氨基酸)和解螺旋酶模序(167⁹26氨基酸)为诱饵,与HeLa细胞cDNA文库杂交,筛选能与人PIF1蛋白不同功能域相互作用的蛋白。结合生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交及β-galactosidase实验等确定阳性克隆。结果 PIF1蛋白PINT功能域杂交共获得17个阳性克隆,生物信息学分析有3个阳性基因,它们分别是CCNDBP1、OTUD5、CAP1。而PIF1蛋白解螺旋酶模序未获得阳性克隆。结论 PIF1蛋白的PINT功能域对调控PIF1的生理功能具有非常重要的作用。     

人PIF1及其截短体重组蛋白的真核表达及其细胞内定位

目的构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)截短体真核表达重组质粒,进行真核表达,并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位。方法以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag 2B质粒中构建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒;通过lipofectamine2000将重组质粒转染人293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达,用免疫荧光法检测其细胞内定位。结果成功构建了PIF1及其截短体真核表达重组体,并在真核细胞内成功表达。确定PIF1定位于核内,PIF1C定位于整个细胞,呈弥散分布,PIF1N主要定位于核内。结论在真核细胞中成功表达了PIF1、PIF1C、PIF1N,且发现PIF1N对PIF1的入核起重要作用,为进一步研究其PIF1及其各结构域奠定了实验基础。