胃癌细胞株SGC-7901及MGC-803中SURVIVIN基因转录与表达的鉴定

目的　探讨胃腺癌细胞株SGC 790 1及MGC 80 3中survivin基因转录与表达情况 ,为胃癌与survivin基因的相关研究提供帮助。方法　①利用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)及DNA序列测定技术检测两种细胞株中survivin基因mRNA转录情况。②采用免疫组织化学染色鉴定两种细胞株survivin基因有无蛋白表达及其表达程度。结果　从提取的胃癌细胞总RNA中扩增出 6 12bp的DNA片段 ,与预期的扩增片段大小相符 ;序列测定显示两细胞株的DNA扩增片段序列与基因库survivin基因mRNA序列完全一致 ;免疫组织化学染色显示两细胞株中均有survivin蛋白表达产物。结论　中国人胃腺癌细胞株SGC 790 1及MGC 80 3中均存在survivin基因的mRNA转录及蛋白的高表达     

人U_6启动子表达载体的构建及在胃癌细胞中的活性鉴定

目的构建人U6(hU6)snRNA启动子驱动的小RNA分子的表达载体,并在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞中鉴定其表达外源性小RNA分子的活性。方法以人基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hU6snRNA启动子序列,并将其克隆入PUC19载体中,命名为PUC-hU6-extra,经测序证明其序列的正确性;用脂质体法转染SGC-7901细胞;用RT-PCR检测U6启动子的转录活性,并测定培养细胞的生长曲线。结果hU6snRNA基因启动子和紧接转录起始点hU6snRNA的前27个核苷酸被成功地克隆入PUC19质粒载体,重组载体在SGC-7901细胞中能高表达小分子RNA,并且未观察到后者对细胞体外增殖的影响。结论成功构建了以hU6snRNA启动子驱动的、能在人胃低分化腺癌SGC-7901细胞内高效转录小分子RNA的表达质粒PUC-hU6-extra。     

siRNA阻断NF-κB信号通路抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖及侵袭

目的采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术下调胃癌细胞株SGC-7901中NF-κB p65基因的表达,探讨其对肿瘤细胞增殖活性和侵袭能力的影响。方法利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)转染入胃癌细胞株SGC-7901中。采用RT-PCR法测定细胞内NF-κB p65mRNA的表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变;采用MTT法测定细胞增殖活性的变化;利用Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭能力的变化。结果与对照组比较,化学合成的人NF-κB p65siRNA能有效地抑制SGC-7901细胞中NF-κB p65mRNA的表达(P<0.05);RelAsiRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组(P<0.05),并且RelA siRNA组中SGC-7901细胞的体外侵袭力减弱,增殖活性降低。结论特异的siRNA可以有效阻断NF-κB信号通路,影响人胃癌细胞的增殖活性和体外侵袭能力。     

SAHA对胃癌MGC-803细胞增殖与周期及凋亡的影响

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(SAHA)对胃癌细胞株MGC-803增殖、凋亡及周期的影响。方法 MTT比色法观察不同药物浓度SAHA作用于培养胃癌细胞株MGC-803时的增殖变化,初步选取药物作用48h时的合适药物浓度,进一步用流式细胞术检测1、2μmol/L SAHA对MGC-803细胞凋亡及周期的影响,Western blot检测乙酰化组蛋白3、4及cyclin D1蛋白的表达情况。结果与正常对照组相比,SAHA处理组细胞增殖能力降低,凋亡率升高,细胞周期内G1期比率升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,SAHA处理组的乙酰化组蛋白3、乙酰化组蛋白4升高,而cyclin D1含量降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA可以抑制MGC-803细胞增殖,通过G1-S期阻滞抑制细胞周期,促进细胞凋亡,可能与促进乙酰化组蛋白3及乙酰化组蛋白4的表达增多有关。     

幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统,表达并纯化Ahp蛋白.方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET30a-ahpC.重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE鉴定.结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%;SDS-PAGE显示,经IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白,且产量较高.结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

Survivin在肾透明细胞癌中的表达及其意义

目的检测抗凋亡基因survivin在肾透明细胞癌中的表达情况及其与肾透明细胞癌生物学特性的关系。方法收集53例肾透明细胞癌组织及8例正常肾组织,以免疫组织化学方法检测survivin蛋白表达;半定量RT-PCR方法,检测肾透明细胞癌中survivin mRNA表达水平,与正常肾组织进行比较分析。结果62.3%(33例)肾透明细胞癌组织表达survivin蛋白,而正常肾组织无1例阳性表达。RT-PCR结果表明,survivin mRNA阳性表达率为56.25%(18/32)。Survivin表达与病理分级、临床分期、有无淋巴结转移等恶性生物学特性密切相关。结论Survivin的高表达与肾透明细胞癌具有密切相关性,提示survivin对于肾透明细胞癌的预后可能具有重要意义。     

生存素在5-氟尿嘧啶诱导人绒癌细胞株JAR凋亡中的作用

目的探讨生存素(survivin)在化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导的人绒癌细胞株(JAR)凋亡中的作用。方法用JAR细胞株进行培养传代,以不同浓度5-Fu作用于JAR细胞,MTT方法观察5-Fu对JAR细胞生长的抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,用逆转录聚合酶链(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)方法检测survivin基因和蛋白的表达。结果①5-Fu对JAR细胞的生长具有抑制作用,并有浓度和时间的依赖性;②5-Fu诱导JAR细胞凋亡,凋亡率随浓度而增加;③5-Fu作用后survivin基因和蛋白表达减少,随浓度增加而减少。结论5-Fu可能是通过降低survivin表达水平,诱导JAR细胞凋亡。     

应用PCR技术克隆人乳头瘤病毒16型E6基因

为进一步研究与宫颈癌发生密切相关的人乳头瘤病毒16型E6基因的转化作用,我们运用PCR技术扩增HPV16 E6 DNA,以pUC—19为载体,大肠杆菌了JM103为宿主菌,组建了质粒pRCE6经限制性核酸内切酶和Southern转印杂交证实,其插入片段约为0.5Kb,含有全部HPV16 E6序列。该质粒的组建为检测HPV感染中mRNA转录提供了特异性的早期基因探针。同时为进一步研究HPV16 E6基因的转化作用及转化蛋白打下基础。     

丙型肝炎病毒C区截短型基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的原核表达系统,获得高产量的纯化核心蛋白。方法应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-Ct,转化HB101宿主菌,通过温度诱导表达截短型C蛋白。结果扩增得到目的基因长度为462bp,构建pBVIL1-Ct表达载体,在HB101宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达,表达蛋白占菌体总蛋白含量的24%。Western-Blot及ELISA检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论羧基端部分缺失的HCV C区基因片段可在大肠杆菌中稳定表达并具有良好的反应原性。     

上调miR-181a对胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-181a对胃癌细胞增殖、周期及凋亡的影响及其作用机制。方法荧光实时定量PCR检测5种胃癌细胞及人胃黏膜细胞系GES-1中miR-181a的表达情况,以及胃癌细胞AGS瞬时转染miR-181amimic后miR-181a的表达情况;MTT法和流式细胞仪检测上调miR-181a表达对胃癌细胞AGS增殖、周期和凋亡等生物学行为的影响;Western blot检测上调miR-181a后细胞周期调控蛋白(CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21)和凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达变化。结果与人胃黏膜细胞系GES-1比较,miR-181a在人胃癌细胞株SGC-7901和MKN28表达升高(P均<0.01),在MGC-803、BGC-823、AGS表达差异无统计学意义(P均>0.05);瞬时转染miR-181amimic后,胃癌细胞AGS中miR-181a的表达明显上调(P<0.05);转染miR-181amimics后AGS细胞增殖明显,G0/G1期细胞减少,S期细胞明显增多,细胞凋亡明显减弱(P均<0.05)。Western blot结果显示,上调miR-181a后胃癌细胞AGS中CDC25A、cyclinA2和Bcl-2表达升高(P均<0.05),cyclinD1和p21表达差异没有统计学意义(P>0.05),Bax表达降低(P<0.05)。结论上调miR-181a可以促进胃癌细胞AGS增殖,其作用机制可能与CDC25A、CyclinA2表达升高有关;上调miR-181a可抑制胃癌细胞凋亡,其作用机制可能与Bcl-2表达升高及Bax表达降低有关。     

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究

目的　构建编码结核分枝杆菌蛋白Ag85A基因为基础的DNA疫苗。 方法　采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因组中 ,扩增出分泌蛋白Ag85A成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后 ,插入克隆载体 pGEM TEasy中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3.1的相应酶切位点。重组质粒肌注免疫小鼠 ,4周后用ELISA法检测抗体滴度。结果　结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A成熟蛋白的编码基因经序列测定证实无突变 ;经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定证实克隆基因正确插入载体 pcDNA3.1。ELISA法检测几何平均滴度为 1∶10 0 0。结论　以Ag85A成熟蛋白的编码基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达 ,为进一步研究其在结核病与肿瘤防治方面的作用奠定了基础     

5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响

目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706,并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化,FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化,RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达,免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态,经5-Aza-CdR处理后,超甲基化状态解除,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡率明显提高(P<0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强,同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P<0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mR-NA表达,当其超甲基化解除后,细胞增殖受到抑制,同时细胞凋亡率相应提高。     

血红素氧合酶-1对胰腺癌细胞增殖的促进作用

目的探讨血红素氧合酶-1(HO-1)对胰腺癌培养细胞增殖能力的影响。方法应用Real-time PCR检测胰腺癌细胞中HO-1 mRNA的表达;应用免疫荧光化学染色和Western blot检测细胞中HO-1定位表达和定量表达;应用基因转染技术构建高表达HO-1的Miapaca-2胰腺癌细胞株和低表达HO-1的Panc-1胰腺癌细胞株,并用MTT法检测胰腺癌细胞的增殖能力变化。结果胰腺癌细胞中存在HO-1的表达,通过在体外实验筛选和构建HO-1不同表达水平的胰腺癌细胞株,结果显示在人胰腺癌Panc-1细胞中,应用ZnPPIX和转染细胞Panc-1-Si-HO-1能够明显抑制胰腺癌细胞的增殖。在Miapaca-2细胞中,应用ZnPPIX明显抑制了胰腺癌细胞的增殖,而Miapaca-2-Sh-HO-1可显著促进胰腺癌细胞增殖。结论 HO-1能明显促进胰腺癌细胞的增殖能力。     

脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7蛋白在NIH/3T3细胞中的表达和定位

目的　将带有人乳头瘤病毒 1 6型 (湖北株 )E7基因的真核表达载体 pL(E7 HB)SN导入NIH/3T3细胞进行瞬时表达。方法　重组质粒转染 3T3细胞通过DNA 磷酸钙共沉淀法 ;E7基因表达的检测采用RT PCR和间接免疫荧光实验。结果　E7基因导入真核细胞后能有效转录并表达E7蛋白 ,通过免疫荧光染色可看到E7蛋白主要定位在胞浆中 ,细胞核中也有 ,但量较少。结论　这可能和湖北株HPV1 6E7基因发生突变有关。     

Survivin在涎腺良性、交界性、恶性多形性腺瘤中的表达及意义

目的探讨Survivin在涎腺良性多形性腺瘤(PA)、交界性多形性腺瘤(RPA)、恶性多形性腺瘤(MPA)中的表达及其与肿瘤增殖活性的相关性。方法应用免疫组织化学方法及原位杂交技术检测14例涎腺PA、9例RPA、11例MPA以及9例癌旁腺组织中Survivin的表达。结果Survivin mRNA在涎腺PA、RPA、MPA中的表达与其蛋白表达相比均无显著性差异,而在癌旁腺体中的表达存在显著性差异(P<0.05);在涎腺PA中Survivin mRNA及其蛋白的表达均明显低于RPA、MPA及癌旁组织(P<0.01),而RPA与MPA中的表达无显著性差异;在MPA中高分化者与中低分化者的表达均有显著性差异(P<0.05)。结论Survivin基因的转录和扩增可能参与多形性腺瘤的发生、发展及恶变进程,并且在肿瘤发生的不同阶段有不同表达,有望成为涎腺肿瘤诊断和治疗的新靶点。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a( )分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a( )/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585 bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a( )/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130 ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a( )/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达。     

外源性p16基因对肾癌细胞周期及体外增殖的影响

目的　观察外源性 p16基因对肾癌细胞周期的影响及其对肾癌细胞的生长抑制作用。方法　利用携带人 p16基因的真核表达载体,采用脂质体介导法将其导入人肾癌细胞系 GRC- 1 中,观察其对瘤细胞的作用。结果　①免疫组织化学方法检测显示转染 p16基因的GRC 1细胞可显著表达 p16蛋白。②流式细胞仪检测证明,外源性 p16 基因可在肾癌细胞周期G1期到S期发挥抑制作用。③与对照组相比,转染 p16 基因的 GRC- 1 细胞生长明显受到抑制。结论　外源性 p16基因具有细胞周期特异性地抑制肾癌细胞生长的作用。