大骨节病关节软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13表达的体外研究

目的体外培养大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)患者和正常对照的关节软骨细胞并对比观察细胞形态、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅹ型胶原表型及基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达变化,以明确KBD软骨细胞的生长特性。方法依据我国"大骨节病临床诊断标准"和病理学变化特征,选择KBD患者为KBD组(n=8),并设立正常对照组(n=8)。在无菌手术条件下采集关节软骨,胶原酶等消化、分离后进行软骨细胞培养,光镜及透射电子显微镜观察形态,免疫组织化学及流式细胞术观察细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原和MMP-13的体外表达变化,对比研究KBD软骨细胞表型表达的特点。结果KBD软骨细胞内空泡及核变形现象较正常增多,并有绒毛及胶原纤维不规则排列等超微结构变化。两组间Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型表达差异显著,其中KBD组Ⅱ型胶原表型表达显著低于对照组(t=-5.54,P<0.001),而MMP-13表达显著增高(t=3.70,P<0.01)。结论KBD软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13的表达不同于正常对照组,以软骨细胞的退行性和增生性变化为著。     

硒对大骨节病和骨关节炎软骨细胞超微结构的影响

目的观察不同浓度硒对体外培养大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)、骨性关节炎(osteoarthritis,OA)和正常关节软骨细胞的超微结构变化,为大骨节病病因、发病机制研究提供科学依据。方法依据《大骨节病诊断标准》选择Ⅱ度和Ⅲ度KBD患者8例、WOMAC诊断的OA7例和非病区正常人意外事故者5例的关节软骨进行体外分离、培养,传1代。KBD组、OA组和正常组分别给予0、0.025、0.05、0.10、0.25mg/L不同剂量的硒,采用透射电镜方法观察细胞超微结构的变化。结果①正常组第6天时,硒质量浓度在0.1~0.25mg/L之间组的细胞明显坏死和细胞器结构丧失,KBD组细胞超微结构细胞器丰富,状态良好,OA组细胞结构完整,细胞器存在,细胞有凋亡和坏死征象;②硒质量浓度在0.025~0.10mg/L组之间KBD、OA细胞超微结构趋于正常细胞,超微结构细胞器丰富,状态良好,而同浓度正常组细胞凋亡、坏死征象明显。3硒质量浓度>0.25mg/L时,KBD、OA组细胞微观结构受损,正常组细胞坏死明显。结论适宜的补硒对KBD、OA软骨细胞生长有一定的保护作用,而正常软骨细胞耐受力低、凋亡坏死较明显。     

大骨节病软骨细胞线粒体功能及其与患者年龄的相关性

目的评估大骨节病患者软骨细胞的线粒体功能及其与年龄的关系。方法关节软骨细胞体外培养,分光光度法测定呼吸链复合体活性,化学发光法检测细胞内ATP,流式细胞仪检测线粒体膜电位和细胞内活性氧含量,线性回归分析线粒体功能与年龄的相关性。结果大骨节病线粒体呼吸链复合体Ⅱ(P=0.001)、Ⅲ(P=0.005)和Ⅳ(P=0.005)活性降低,柠檬酸合酶活性升高(P=0.04),细胞内ATP含量减少(P=0.001),线粒体膜电位下降(P=0.001),细胞内活性氧含量增加(P<0.001);线粒体功能与年龄在大骨节病和正常对照组均无显著相关性。结论大骨节病软骨细胞存在线粒体功能障碍,线粒体功能与年龄间无显著相关性。     

川芎嗪对体外培养兔关节软骨细胞MMP-1、MMP-13和TIMP-1表达的影响

目的研究川芎嗪对IL-1β诱导的兔关节软骨细胞损伤的影响。方法体外分离培养兔关节软骨细胞,并以其为实验模型;将实验分为正常对照组、白介素组、川芎嗪+白介素组;MTT法检测细胞增殖情况;Real-time PCR检测MMP-1、MMP-13和TIMP-1的mRNA表达量。结果 MTT检测结果显示,川芎嗪+白介素组细胞增殖情况显著高于正常对照组和白介素组(P<0.05);Real-time PCR结果显示,川芎嗪+白介素组MMP-1和MMP-13的mRNA表达量显著低于白介素组(P<0.05),而TIMP-1的mRNA表达量则显著高于白介素组(P<0.05)。结论川芎嗪可抑制IL-1β对软骨细胞的炎症损伤,具有保护软骨细胞,延缓软骨基质降解的作用,临床上可作为OA的治疗用药。     

大骨节病儿童及成人关节软骨细胞凋亡特征的比较

目的探讨细胞凋亡及相关调控因子Bcl-2、Bax在大骨节病(KDB)儿童和成人关节软骨中的表达及分布的异同。方法收集15例大骨节病儿童和12例大骨节病成人,采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的脱氧核糖核酸缺口标记(TUNEL)技术和Bcl-2、Bax免疫组化抗生物素蛋白-生物素-碱性磷酸酶(B-SA)法染色,比较正常儿童和成人与大骨节病儿童和成人关节软骨中软骨细胞凋亡及相关调控因子Bcl-2和Bax的表达。结果KDB儿童关节软骨中层凋亡阳性细胞数较正常关节软骨显著增多(P<0.01);成人KDB关节软骨凋亡阳性细胞分布以表、中层显著(P<0.05)。②KDB儿童关节软骨表、中层Bcl-2、Bax的表达显著高于正常关节软骨中的表达(P<0.01),其中表层最高。③KDB成人关节软骨各层Bcl-2、Bax的表达显著高于正常关节软骨中的表达(P<0.05),其中表层最高。④KBD成人关节软骨各层凋亡细胞、Bcl-2、Bax阳性表达率均较KBD儿童显著增高,且Bax的表达较Bcl-2表达增多。结论KBD成人关节软骨凋亡细胞、Bcl-2、Bax阳性表达率均较KBD儿童显著增高,且Bax的表达较Bcl-2表达增多。     

胎儿软骨细胞体外培养过程中生长及代谢的变化

目的探讨体外培养的软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达变化,为组织工程软骨种子细胞选择合适的回植时机。方法取体外培养的第1-5代胎儿软骨细胞,观察细胞形态和细胞增殖率;用爱茜蓝(alcianblue)法检测软骨细胞聚集蛋白聚糖中糖胺聚糖含量;分别用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应检测Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖在蛋白和mRNA水平的表达。结果体外培养的胎儿软骨细胞从第3代起逐渐向成纤维样细胞转换;各代软骨细胞糖胺聚糖的含量随传代次数的增加而逐渐降低,第3代后处于较低水平;第2代以前Ⅱ型胶原表达较强,Ⅰ型胶原表达较弱,之后随传代Ⅱ型胶原表达减弱,Ⅰ型胶原表达逐渐增强;而聚集蛋白聚糖在第3代以前表达较高,从第4代后明显下降。结论人胎儿软骨细胞体外培养过程中,第2代软骨细胞从形态和功能上最接近体内状况,可作为软骨组织工程的种子细胞。     

IL-1β和MMP-13在兔骨关节炎模型软骨和滑液中的表达

目的评价兔膝关节内侧半月板损伤制作骨关节炎(OA)模型的方法的可行性,探讨白细胞介素-1β(IL-1β)和金属蛋白酶-13(MMP-13)在兔骨关节炎模型软骨和滑液病变中的作用机制。方法新西兰大白兔40只,随机分为实验组(n=30)和对照组(n=10),于术后2、6、12周观察股骨髁关节软骨的病理变化并进行评分;用免疫组化方法检测关节软骨中IL-1β和MMP-13的表达情况;用酶联免疫吸附法测定关节液中IL-1和MMP-13的含量。结果实验组和对照组在大体和病理观察不同时间点关节软骨评分及HE染色差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学检测结果显示IL-1β在两组中均有表达,实验组和对照组2周时细胞分数差异无统计学意义,6、12周差异有统计学意义(P<0.05)。MMP-13在对照组关节软骨细胞中未见表达,实验组的关节软骨细胞中可见MMP-13蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关节滑液中IL-1β表达和在软骨中表达一致。结论采用损伤兔膝关节半月板的方法可建立合理的动物OA模型;IL-1β和MMP-13在OA发病过程中表达水平有明显变化,需要进一步的临床研究来探讨其是否可以作为早期诊断OA的指标之一。     

线粒体细胞色素c介导的caspase-9激活通路参与大骨节病关节软骨细胞凋亡的发生机制

目的通过评价线粒体功能研究线粒体介导的caspase-9激活通路参与成人大骨节病关节软骨细胞凋亡的机制。方法关节软骨细胞培养,Hoechst 33258染色检测软骨细胞核形态,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率和细胞内活性氧含量,Western bloting检测细胞色素c的表达,荧光法检测caspase-9和caspase-3活性。结果大骨节病患者关节软骨细胞较正常软骨细胞凋亡百分率增加,线粒体细胞色素c释放,caspase-9和caspase-3活性增高,且活性氧含量增加。结论线粒体氧化应激参与了大骨节病软骨细胞的病理生理变化,线粒体功能障碍可能在大骨节病关节软骨细胞凋亡过程发挥了重要作用。     

大骨节病（发生在中国的一种地方性骨关节病）关节软骨代谢

目的 本研究旨在了解大骨节病(KBD,在中国发生的一种地方性骨关节病)患者软骨CD44和蛋白聚糖的代谢及相关影响.方法 用免疫组织化学方法分析分化抗原-44(CD44)、BC-13以及3-B-3(-)在所采集KBD患者和正常人软骨切片中的表达;采用夹心酶联免疫吸附测定法检测血清中可溶性CD44(sCD44)、白介素-1β(IL 1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)以及基质金属蛋白酶-1的水平.结果 苏木素&伊红(HE)染色以及甲苯胺兰染色显示,在KBD病患儿以及成人软骨中有细胞坏死和蛋白聚糖的缺失;免疫组织化学染色发现,KBD成人和儿童患者软骨组织中CD44、BC-13和3-B-3(-)具很强的阳性表达;sCD44、IL-1β和TNF-α在KBD成人和儿童血清的水平明显高于正常成人及儿童对照组,经统计学分析具显著性差异.有意思的现象是,KBD病区正常儿童血清中IL-1-β和TNF-α的水平亦明显高于非KBD病区正常儿童的水平,这些都提示可能还有一些未被确定的因素(例如遗传因素)或许对KBD发病具有一定的影响.结论 大骨节病患者CD44、IL-1β和TNF α代谢发生的改变,以及KBD成人和儿童软骨由于聚集蛋白聚糖酶活性增强所产生的蛋白聚糖的丢失,可能是KBD发病机理中起关键作用的重要因素,可以引起病态的关节形成和关节的不稳定,这些都可以导致在KBD患者中发生继发性的骨性关节炎.     

大骨节病患者外周血真菌毒素环境反应基因表达谱的研究

目的比较分析真菌毒素环境反应基因在大骨节病(KBD)患者和正常对照者外周血中的表达谱差异,探讨其与KBD患病风险的相关性。方法收集25例KBD成年患者和17例正常对照个体外周血样品,提取总RNA。采用Agilent全基因组表达芯片、单基因表达分析和基因集富集表达分析技术(GSEA),比较真菌毒素环境反应基因在KBD患者和正常对照个体外周血中的基因表达谱差异。基因表达芯片数据采用RT-PCR进行验证。结果①T-2毒素、雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、脱氧镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素B1、赫曲霉毒素A和胶霉毒素相关的11个环境反应基因在KBD患者和正常对照个体外周血中的表达水平存在显著差异(表达率>2.0或<0.5),功能主要涉及细胞凋亡、免疫炎症和蛋白合成与修饰等。②真菌毒素相关的11个环境反应基因在KBD患者外周血中显著上调(P<0.05),功能涉及细胞凋亡、外环境刺激反应、生长发育和氧化还原反应等。结论多种真菌毒素环境反应基因在KBD患者外周血中表达异常。真菌毒素可能通过影响相关环境反应基因的表达,诱发软骨细胞功能障碍,导致关节软骨损伤。     

低硒大骨节病病区粮对大鼠软骨Ⅱ型胶原合成代谢的影响

为探讨病区粮及硒对软骨胶原代谢的影响,采用低硒大骨节病病区粮,病区粮加硒和非病区粮喂养大鼠66d,观察了低硒KBD病区粮和硒对软骨Ⅱ型胶原合成代谢的影响。结果表明:①病区组Ⅱ型胶原甘氨酸、丙氨酸等疏水氨基酸含量较非病区组增高,羟脯氨酸和羟赖氨酸含量降低。病区粮加硒后上述变化可得到部分纠正。②病区组软骨Ⅱ型胶原脯氨酸和赖氨酸羟化程度分别较非病区组降低6.4%和7.7%。加硒组较病区组脯氨酸羟化程度增高9.4%,但赖氨酸羟化程度未增高。③病区组Ⅱ型胶原电泳迁移率及对胰蛋白酶敏感性与其它组无显著差别。     

脱钙松质骨体外构建组织工程软骨的实验研究

目的软骨细胞复合同种异体脱钙松质骨(demineralized cancellous bone,DCB)体外构建组织工程软骨,评价DCB作为组织工程软骨支架的可行性。方法取新西兰兔长骨干骺端松质骨制备DCB,扫描电镜观察;分离幼兔关节软骨细胞,原代培养后种植在同种异体DCB体外培养,分别于7、14、21、28、35、42d取材进行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝(TB)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原染色。结果制备的DCB成三维立体多孔结构,孔隙大小100~500μm,有良好的可塑性和一定的力学强度;软骨细胞在DCB表面和空隙内生长、分化良好,形成软骨陷窝,分泌基质蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。培养42d软骨细胞在DCB表面及孔隙内形成软骨样组织。结论 DCB复合同种异体软骨细胞在体外成功构建了组织工程软骨,是一种较理想的软骨组织工程支架材料。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的　建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法 ,诱导其表达软骨细胞表型。方法　抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导 ,观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果　①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁 ,可提高细胞分离率 ;②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合可促进MSCs增殖 ,表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论　①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖 ,表达软骨细胞表型     

大骨节病和腺病毒感染的相关性研究

目的研究腺病毒感染与大骨节病(KBD)发病的关系。方法用巢式聚合酶链式反应(Nest-PCR)检测KBD病区和非病区儿童全血及KBD患者血清接种软骨细胞的腺病毒DNA,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测KBD病区和非病区儿童血清腺病毒IgG抗体。结果KBD病区KBD儿童、病区对照组儿童和非病区儿童全血腺病毒DNA的阳性率分别为33.33%、34.92%和28.57%,腺病毒IgG抗体的阳性率分别为68.29%、65%和68.97%,差异无统计学意义(P>0.05);KBD患者血清培养细胞腺病毒DNA的PCR结果均为阴性。结论KBD病区和非病区儿童腺病毒均有较高的检出率;KBD的发病和腺病毒感染可能无直接病因学关系。     

海藻酸盐小球中培养的软骨细胞的生长

目的为海藻酸盐水凝胶作为软骨细胞三维培养环境提供实验依据。方法将酶消化法获取的P1代软骨细胞包裹在20 g/L海藻酸钙凝胶小球中持续培养4周,在培养的不同时间点取适量的小球行倒置相差显微镜观察,HE、番红"O"染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色;并通过MTT法检测细胞活性及增殖;二甲基亚甲兰法进行氨基葡聚糖(GAG)含量测定。结果在海藻酸钙小球内培养的软骨细胞能够保持球形状态,且随时间的延长,细胞增殖逐渐聚集成簇;细胞外基质沉积逐渐增加,GAG含量增多。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞。结论软骨细胞在海藻酸盐凝胶小球中培养有效维持了细胞的分化状态,细胞增殖并具有良好的分泌蛋白功能。海藻酸钙凝胶适合于软骨细胞的生长。     

自由基对兔关节软骨细胞超微结构的影响

本研究采用体外培养兔关节软骨细胞的方法,建立黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系产生的内源性自由基对软骨细胞影响的实验模型。用倒置显微镜动态观察,扫描及透射电镜超微结构观察等研究方法,初步探讨了内源性自由基对兔关节软骨细胞的影响。结果表明:黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系产生的内源性自由基对软骨细胞具有损伤作用。提示软骨老化、变性、一些变性性关节疾病,如大骨节病、关节炎的发生可能与自由基有关。     

慢性肝病患者血清Ⅰ、Ⅲ型胶原变化及其意义

应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了139例慢性肝病患者及30例正常对照血清Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。结果发现，在慢迁肝、慢活肝及肝硬化各组其含量逐渐上升，Ⅰ型胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值能更好地反映肝纤维化程度。相关性分析表明二者与反映肝细胞损伤指标均不相关。提示Ⅰ型胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值是判定肝纤维化状况的较可靠指标。     

氧自由基对人胚软骨细胞DNA基质成分及超微结构的影响

本实验采用体外软骨细胞培养方法,观察由黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶产生的自由基对人胚软骨细胞DNA、基质蛋白多糖、胶原合成功能及超微结构的影响。结果表明该酶系产生的自由基抑制人胚软骨细胞DNA、蛋白多糖、胶原的合成,对软骨细胞膜及细胞器具有明显的损伤作用,从而间接说明某些炎性关节疾病时活化中性粒细胞、巨噬细胞释放的氧自由基是引起关节软骨损伤的重要因素。     

DON毒素和硒对软骨聚集蛋白聚糖硫酸化修饰的影响

目的研究大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)可疑致病因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和补硒对软骨细胞外基质聚集蛋白聚糖(aggrecan)硫酸化修饰的影响。方法应用体外单层培养C28/I2人软骨细胞,采用MTT法测定不同浓度DON和不同作用时间下的细胞增殖活性,通过Real-time PCR和Western-blot法分别检测加DON毒素或补硒后软骨细胞的aggrecan、PAPS合成酶2(PAPS synthetase 2,PAPSS2)、PAPS转运体1(PAPS transporter 1,PAPST1)、N-乙酰氨基半乳糖胺-4,6-硫酸转移酶[carbohydrate(N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O)sulfotransferases 15,CHST15]以及芳基硫酸酯酶B(arylsulfatase B,ARSB)mRNA和蛋白的表达水平。结果 DON毒素可抑制C28/I2软骨细胞系的增殖活性,在DON毒素作用下aggrecan、PAPSS2、PAPST1和CHST15的mRNA和蛋白质表达水平降低,ARSB mRNA和蛋白质表达水平升高,加硒可在一定程度上改善这种状况。结论 DON毒素对软骨细胞的增殖有明显的抑制作用,细胞对毒素有一浓度和时间的依赖性;DON毒素可通过改变aggrecan硫酸化修饰相关酶类的表达水平影响软骨蛋白聚糖的硫酸化。     

大骨节病病因病理学研究

目的 寻找并认定大骨节病(Kashin-Beck disease, KBD)的病因。方法 复查本所KBD剖检档案16例的骨切片。光镜观察KBD患儿末梢血涂片中白细胞的病变,电镜观察患儿白细胞的超微病变。观察KBD患儿血浆引发培养兔软骨细胞损伤的实验结果。结果 KBD剖检例的软骨细胞、骨髓血细胞及KBD患儿的白细胞,这三类细胞病变的特征及其全过程完全一致,均显示特异的凝固性坏死,细胞核增大,核内出现由少到多、由小到大的嗜酸性(红色)包涵体,伴随以细胞核染色质的溶解减少;若病变持续恶化进展,则整个细胞核可转化成一个红染的大团块;其后出现该包涵体的后续性系列变化;细胞体缩小,细胞质红染。患儿血浆引发培养兔软骨细胞复制出等同于剖检例软骨细胞特异坏死病变的细胞模型,且在其细胞核内检可见病毒核衣壳。在患儿白细胞的核内亦可见相同的病毒核衣壳。在剖检例的骨髓内可见充血、水肿、纤维素渗出,造血主质和骨小梁的灶性坏死以及骨髓纤维化等。结论 在KBD剖检例病变的软骨细胞和骨髓血细胞的核内及KBD病患儿末梢血白细胞的核内均显示相同的包涵体形成;包涵体形成是病毒杀细胞性感染最为熟知的病理形态学结果;特别是以KB...