骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定

目的建立兔骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法抽取兔胫骨骨髓,密度梯度离心,得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性。通过免疫荧光组织化学、流式细胞分析和透射电镜鉴定细胞。结果分离培养的骨髓MSCs贴壁、呈梭形,原代细胞呈集落生长,7～10d达到融合,传代后增殖速度加快;骨髓MSCs表达CD90,反复传代后表达效率增高,不表达CD34;透射电镜可见细胞表面有大量的绒毛突起,胞浆中有丰富的粗面内质网和线粒体,核大,形态不规则。结论密度梯度离心结合贴壁法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,分离培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。     

TGF-β1对成人骨髓CD105~+间充质干细胞增殖与分化的影响

目的分离并鉴定成人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),研究TGFβ1对骨髓MSCs增殖与分化的影响。方法分离成人骨髓单个核细胞;MACS磁珠分选CD105+细胞;FACS检测其免疫表型;诱导分选的CD105+细胞向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色、VonKossa染色及RTPCR检测脂肪细胞及成骨细胞;观察TGFβ1对分选出的CD105+细胞分化与增殖的影响;免疫荧光染色检测诱导后的脂肪细胞CD105的表达情况;MTT法检测TGFβ1对CD105+细胞增殖的影响。结果成人骨髓来源的CD105+细胞体外可向脂肪及成骨细胞分化;在向脂肪细胞分化过程中,加入1～50ng/mLTGFβ1后,成脂诱导体系中无脂肪细胞出现;在向成骨诱导过程中,加入20ng/mLTGFβ1后,钙化基质沉淀明显降低;在脂肪诱导体系中,MTT染色检测显示TGFβ1对CD105+细胞的增殖有明显促进作用(P<0.05)。结论TGFβ1抑制成人骨髓源CD105+MSCs向脂肪及成骨细胞分化,在向脂肪诱导过程中,TGFβ1促进MSCs的增殖。     

大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验

目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,进行骨向分化诱导,并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨,为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,MSCs能够向成骨细胞分化,骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。     

TGF-β诱导骨髓干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)对骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用TGF-β1对第二代MSCs定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学技术检测诱导后4周MSCs结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白T(CTnT)及p38MAPK的表达情况,并根据CTnT这一心肌源性特异性标记物的阳性率,分析心肌细胞的转化率;同时,以半定量RT-PCR方法在诱导后7、21、28d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性肌凝蛋白重链α-MHC的表达。结果①加入TGF-β1诱导后的MSCs,于7d时形态已转变成类长柱形,28d时细胞体积则变小,呈条梭状排列,可观察到类肌管样结构。②TGF-β1诱导4周后的MSCs均可见desmin、α-sarcomeric actin及p38MAPK阳性细胞。诱导组的心肌样细胞转化率均显著高于对照组(P均<0.01)。③RT-PCR结果显示,诱导组细胞GATA-4于诱导后7d弱表达,21d表达增强,28d表达减弱。α-MHC在诱导后7d不表达,21d弱表达,28d表达明显。结论骨髓间充质干细胞在TGF-β诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定;应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性.结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs,HE染色显示细胞均一性好;CD44强阳性表达,CD34阴性表达.诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性,ALP染色阳性;成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性,油红"O"脂肪染色阳性.结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率。方法应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs,贴壁法不断纯化,流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达,然后用pEGFP-N3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率。结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形,有聚集生长的倾向,多3~5个细胞成为一个集落。传代后,细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样,长梭形,胞浆突起较少,胞体轮廓不甚清晰,胞体也相对较大;②GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达最强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达;③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关,1∶2到1∶3最高。结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;GFP转染是一种较好的MSCs标记方法。     

大骨节病关节软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13表达的体外研究

目的体外培养大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)患者和正常对照的关节软骨细胞并对比观察细胞形态、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅹ型胶原表型及基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达变化,以明确KBD软骨细胞的生长特性。方法依据我国"大骨节病临床诊断标准"和病理学变化特征,选择KBD患者为KBD组(n=8),并设立正常对照组(n=8)。在无菌手术条件下采集关节软骨,胶原酶等消化、分离后进行软骨细胞培养,光镜及透射电子显微镜观察形态,免疫组织化学及流式细胞术观察细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原和MMP-13的体外表达变化,对比研究KBD软骨细胞表型表达的特点。结果KBD软骨细胞内空泡及核变形现象较正常增多,并有绒毛及胶原纤维不规则排列等超微结构变化。两组间Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型表达差异显著,其中KBD组Ⅱ型胶原表型表达显著低于对照组(t=-5.54,P<0.001),而MMP-13表达显著增高(t=3.70,P<0.01)。结论KBD软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13的表达不同于正常对照组,以软骨细胞的退行性和增生性变化为著。     

低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

目的利用低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞定向分化。方法分离人骨髓,利用梯度离心法进行MSCs的培养,取第三代细胞利用低强度间断负压诱导分化;倒置显微镜下观察细胞的形态,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色观察钙结节形成,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达。结果低强度间断负压诱导2周后,细胞呈现出成骨细胞形态,ALP活性明显增强,茜素红染色可见钙结节形成,Ⅰ型胶原和骨保护素表达阳性。结论利用低强度间断负压可以成功的诱导MSCs向成骨细胞定向分化,诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。     

微囊化软骨细胞诱导间充质干细胞定向分化治疗兔椎间盘退变的实验研究

目的探讨经微囊化软骨细胞诱导分化的间充质干细胞对兔椎间盘退变的治疗效果。方法将微囊化软骨细胞与间充质干细胞进行共培养,干细胞诱导分化。观察分化后干细胞的免疫学特征、增殖曲线、蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白合成能力。建立兔椎间盘退变模型,并观察分化后的间充质干细胞对兔椎间盘退变的修复能力。结果经微囊化软骨细胞分化诱导7d后的间充质干细胞,增殖能力未受到明显影响,同时具备了软骨细胞的部分表面特征,能够合成蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白,且能力优于Transwell对照组。将干细胞植入兔椎间盘退变模型中,在术后16周内,椎间盘的力学性能得到修复,形态及结构也得到了明显改善。结论与传统的Transwell诱导体系相比,微囊诱导体系具有更高的诱导效率;经微囊化软骨细胞诱导的MSCs,植入椎间盘退变模型动物体内后,能更好地维持椎间盘的形态、结构及力学特征。     

大鼠骨髓间充质干细胞对RH-35肝癌细胞侵袭能力的影响

目的观察大鼠骨髓来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对RH-35肝癌细胞侵袭能力的影响。方法密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓MSCs,成骨与成脂诱导分化鉴定其分化能力。收集MSCs条件培养基(MSCs-CM),与RH-35细胞共培养72h,Transwell小室观察MSCs-CM对RH-35细胞侵袭转移能力的影响;Realtime PCR与Western blot法检测Snail与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达。结果分离的MSCs形态均一,具有良好的成骨与成脂分化能力。在MSCs-CM(500mL/L)作用下,RH-35的侵袭能力明显增强;Real-time PCR与Western blot均显示,MSCs-CM处理组中RH-35细胞Snail和MMP-9的表达较对照组显著升高(P<0.05)。结论MSCs在体外能够增强肝癌细胞系RH-35的侵袭转移能力,其促肝癌细胞体外侵袭可能与Snail与MMP-9表达上调有关。     

ISOLATION AND INDUCTION OF RABBIT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS TO EXPRESS CHONDROCYTIC PHENOTYPE

Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＭＳＣｓ)ｗｅｒｅｍｕｌｔｉｐｏ ｔｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｓ ,ｌｏｃａｔｅｄｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ,ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓ ｃｌｅａｎｄｓｙｎｏｖｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅ ,ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｔｅｉｎｔｏｓｅｖｅｒａｌｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌｓ,ｓｕｃｈａｓｏｓｔｅｏｃｙｔｅ ,ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅａｎｄａｄｉｐｏｃｙｔｅ[1,2 ] .ＳｅｐｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＣｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｖｅｎｉｅｔ ,ａｕｔ…     

hGDF5基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的探讨人生长分化因子5(hGDF5)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用脂质体介导方法将hGDF5基因转入体外培养的兔BMSCs,用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、间接免疫荧光检测hGDF5 mRNA和蛋白质的表达,并通过检测碱性磷酸酶活性、细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖(PG)的表达,分析转染hGDF5对BMSCs增殖、分化的影响。结果hGDF5 mRNA及蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hGDF5基因转染组和对照组相比,ColⅡ、PG表达水平显著增高(P<0.01,P<0.01),而碱性磷酸酶活性和细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hGDF5。高表达的hGDF5可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖和碱性磷酸酶活性无明显影响。     

人骨髓间充质干细胞生物学特性及腺病毒介导的GFP标记

目的建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分离、培养以及鉴定的方法,同时应用腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)检测细胞转染的效率。方法应用人淋巴细胞分离液(Ficoll)对hMSCs进行分离,经贴壁纯化后用MTT法检测增殖能力;并对其成骨、成脂、成平滑肌诱导分别进行碱性磷酸酶(ALP)、油红O染色及α-SMA免疫细胞化学检测;采用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面标志的表达。用Ad-GFP转染,并应用荧光显微镜与FCM检测转染效率。结果 hMSCs镜下为成纤维样形态,约在第4天进入对数增长期;分化诱导后ALP染色、Von kossa银染、油红O染色以及α-SMA均为阳性;FCM检测CD14、CD31、CD45表达阴性,CD44、CD73、CD106及PDGFRβ表达阳性;当感染复数MOI=200,细胞培养48h时感染效率较高,FCM检测显示为99.81%。结论经过对增殖、分化能力以及表面标志的分析,证明用Ficoll可以分离得到较纯的hMSCs,Ad-GFP可以很好地感染细胞,为组织工程种子细胞的体内示踪提供了途径。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞间质合成的影响

目的　观测血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛小梁细胞间质合成的影响 ,探讨原发性开角青光眼的发病机制。方法　①体外培养牛眼小梁细胞 ,应用免疫组化方法 (NSE ,Ⅷ因子相关抗原染色 )鉴定细胞 ,光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察 ;②AngⅡ (1×1 0 -7mol·L-1及 1× 1 0 -8mol·L-1)及其Ⅰ型受体拮抗剂孵育牛眼小梁细胞 ,免疫荧光染色测定纤维粘连蛋白 ,并用化学方法检测培养液中羟脯氨酸含量间接推导胶原含量。结果　牛眼小梁细胞培养成功 ,以上皮型为主。AngⅡ明显地增加了牛眼小梁细胞纤维粘连蛋白 ,同时培养液中的羟脯氨酸含量亦相应增高 (P <0 0 5 )。结论　体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术。AngⅡ可以促进纤维粘连蛋白、胶原合成增强 ,AT1受体拮抗剂可以部分阻断此促增殖效应。     

Saikosaponin D inhibits proliferation and induces apoptosis via C/EBPβ-p53 signal pathway in human hepatoma HepG2 cells

Objective To investigate the anticancer effects and detailed mechanisms of Saikosaponin D (SSD) in human hepatoma HepG2 cells. Methods Cell proliferation and apoptosis were tested by MTT assay and Annexin-V/PI assay respectively. The expressions of CCAAT enhancer binding protein β(C/EBPβ) and p53 were detected by RT-PCR and Western blotting. Results SSD inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner and induced apoptosis at the concentration of 5.0mg/L. SSD significantly increased the mRNA and protein levels of C/EBPβ and p53 in a dose-dependent manner. Conclusion SSD exerts its anticancer effect by inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis partly through C/EBPβ-p53 signal pathway in HepG2 cells.     

胎儿软骨细胞体外培养过程中生长及代谢的变化

目的探讨体外培养的软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达变化,为组织工程软骨种子细胞选择合适的回植时机。方法取体外培养的第1-5代胎儿软骨细胞,观察细胞形态和细胞增殖率;用爱茜蓝(alcianblue)法检测软骨细胞聚集蛋白聚糖中糖胺聚糖含量;分别用免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应检测Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖在蛋白和mRNA水平的表达。结果体外培养的胎儿软骨细胞从第3代起逐渐向成纤维样细胞转换;各代软骨细胞糖胺聚糖的含量随传代次数的增加而逐渐降低,第3代后处于较低水平;第2代以前Ⅱ型胶原表达较强,Ⅰ型胶原表达较弱,之后随传代Ⅱ型胶原表达减弱,Ⅰ型胶原表达逐渐增强;而聚集蛋白聚糖在第3代以前表达较高,从第4代后明显下降。结论人胎儿软骨细胞体外培养过程中,第2代软骨细胞从形态和功能上最接近体内状况,可作为软骨组织工程的种子细胞。     

血管内皮生长因子与转化生长因子β在非小细胞肺癌的表达及其相关性

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)与转化生长因子 β(TGFβ)在非小细胞肺癌的表达及其相关性。方法　应用SP免疫组化方法研究VEGF和TGFβ1在 5 0例非小细胞肺癌 (NSCLC)的表达。结果　VEGF阳性显色主要分布于癌细胞的胞浆内 ,表达率为 66% ,其表达与NSCLC的病期进展、淋巴结转移有关 ;TGFβ1阳性表达主要分布于癌细胞的胞浆内 ,细胞核内无表达 ,表达率为 60 % ,其表达与NSCLC的病期进展、淋巴结转移有关 ,且两者表达在癌组织与癌旁组织之间均有显著性统计学意义。 3 3例VEGF阳性表达标本中 ,单纯VEGF表达阳性者 ( 9/3 3 )明显低于VEGF与TGFβ1同时表达阳性者 ( 2 4/3 3 ) ;3 0例TGFβ1表达阳性者中 ,单纯TGFβ1表达阳性 ( 6/3 0 )也明显低于二者均阳性表达者 ( 2 4/3 0 ) ,VEGF与TGFβ1表达之间存在正相关关系 (r =0 .3 62 ,P <0 .0 1)。结论　VEGF和TGFβ1在NSCLC均有较好的表达。TGFβ1通过对VEGF表达的正向调控协同促进了NSCLC的病期进展和淋巴结转移