DNA损伤修复基因与人鼻咽癌细胞辐射耐受CNE-2R细胞的相关性研究

目的探讨射线诱导后DNA损伤修复相关基因在放射敏感性不同鼻咽癌细胞系CNE-2、CNE-2R的差异表达。方法中性彗星分析法检测细胞DNA的双链断链(DSB);免疫荧光技术检测磷酸化组蛋白γH2AX焦点形成、射线照射后细胞放射性损伤的时间剂量效应及放射敏感性的变化;基因芯片(OHS-029)技术检测CNE-2及CNE-2R细胞2Gy照射前后的基因差异表达;Western blot方法验证二者的差异表达蛋白质。结果 4Gy的9MeV-β射线照射后2h,CNE-2R细胞与CNE-2细胞相比,细胞DNA损伤程度加重,且随时间的延长更为明显。荧光显微镜显示,2Gy的9MeV-β射线照射后6h,CNE-2各时间段细胞γH2AX阳性细胞率明显高于CNE-2R组。DNA损伤相关基因表达谱分析发现,CNE-2和CNE-2R细胞相比,差异表达的DNA损伤修复相关基因共37个,其中上调基因24个,下调13个,其中6个位点差异6倍以上,3个位点低于0.1的差异表达;Western blot结果显示,与CNE-2细胞相比,GADD45a、RRAD1在CNE-2R中的表达水平明显下调,而ERCC1及PRKDC蛋白质明显上调,与基因芯片的研究结果一致。结论 9MeV-β射线照射后CNE-2细胞DNA的损伤程度较CNE-2R细胞明显,CNE-2R细胞放射抗拒性与DNA损伤修复能力的基因差异表达相关。通过对筛选出的靶基因进行调控,有可能改变细胞的放射敏感性。     

USP39抑制肿瘤细胞放射敏感性的机制

目的探讨泛素特异性肽酶39(ubiquitin-specific peptidase 39, USP39)对肿瘤细胞DNA损伤应答通路的生物学作用。方法将不同肿瘤细胞系(293T, HeLa, U2OS, T47D)分别在含有100 mL/L FBS的DMEM或RPMI-1640培养基中,在37℃含有50 mL/L CO_2的培养箱中培养;用MTS[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium, inner salt]方法检测敲低USP39对肿瘤细胞放射敏感性的影响;流式细胞术检测同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)修复效率;Western blot检测敲低USP39对DNA损伤应答相关分子的表达情况;用免疫共沉淀、蛋白纯化及质谱技术,检测与USP39相互作用的蛋白并且进行基因本体论(gene ontology, GO)分析;通过微辐射诱导DNA损伤并利用激光共聚焦显微镜检测其募集至DNA损伤位点的情况。结果敲低USP39导致肿瘤细胞的放射敏感性显著增加(P<0.05);敲低USP39显著抑制肿瘤细胞的HR与NHEJ修复效率(P<0.05);敲低USP39能够促进DNA损伤应答因子蛋白的表达;USP39能够聚集至DNA损伤位点;USP39相互作用蛋白与多个DNA损伤应答相关的信号通路有关。结论 USP39对DNA损伤应答过程具有重要作用。     

雪腐镰刀菌烯醇对培养软骨细胞DNA影响及硒的保护作用

目的　探索雪腐镰刀菌烯醇 (NIV)对培养软骨细胞DNA损伤作用及硒的保护作用。方法　应用软骨细胞单层培养、碱性单细胞微量凝胶电泳、琼脂糖电泳和生化方法检测软骨细胞DNA量及损伤情况。结果　在实验设定的NIV浓度范围内 ,随NIV浓度增加DNA含量减少、DNA受损细胞增多和DNA损伤加重 ,同浓度NIV加硒组损伤情况好于未加硒组。结论　NIV对培养软骨细胞有明显损伤作用 ,加硒有保护作用。     

诊断超声对人早孕绒毛细胞DNA影响的定量研究

目的　探讨诊断超声经腹照射子宫内孕囊对人早孕绒毛细胞DNA的影响。方法　 60名拟行人流的早孕妇女随机分为照射 1 0min组和未照射组 ,各 3 0例。取绒毛组织后 ,以紫外分光光度法和3 2 P标记Alu探针打点杂交法定量检测绒毛细胞DNA单、双链断裂。结果　两种方法检测结果显示 ,照射组与对照组绒毛细胞单、双链DNA的量均无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　诊断超声宫内照射孕囊 1 0min ,未引起人绒毛细胞DNA单、双链断裂 ,提示未引起绒毛细胞DNA损伤     

辐射耐受性宫颈癌细胞系的建立及DNA损伤修复相关基因的差异表达

目的筛选来源相同辐射耐受性不同的宫颈低分化鳞癌细胞DNA损伤修复相关基因的差异表达,探讨宫颈癌辐射耐受的机制。方法用9MeV-β射线反复多次间歇大剂量照射人宫颈低分化鳞癌细胞株SiHa,建立辐射耐受性细胞SiHaR,用DNA损伤修复相关PCR基因芯片检测SiHa与SiHaR差异表达基因,并对筛选出的部分基因进行Western blot验证。结果 SiHa及SiHaR细胞经射线照射后呈指数性杀灭,同一剂量照射后SiHaR细胞存活分数(survival fraction,SF)值更高,SiHaR细胞在2Gy照射后细胞存活分数(SF2)是SiHa的2.26倍;二者有差异表达的DNA损伤修复相关基因41个,其中上调基因27个,下调14个。有13个位点出现6倍以上或低于0.1的差异。Western blot对4个差异表达蛋白质验证结果提示,与SiHa细胞相比,糖尿病关联Ras相关基因(ras-related associated with diabetes,RRAD1)、复制因子C2[replication factor C(activator 1)2,RCF2]在SiHaR表达水平明显下调,而X线修复交叉互补基因1(X-ray repair complementing defective repair,XRCC1)及切除修复交叉互补基因(excision repair cross-complementing,ERCC1)蛋白质明显上调。结论人宫颈癌细胞系SiHa经间歇性大剂量射线多次照射后筛选获得的SiHaR细胞具有稳定的辐射耐受性;这与DNA损伤修复能力在基因水平上发生了某些突变明显相关。这为通过调控相关基因进行放射敏感性调控提供了依据。     

H_2O_2诱导SD大鼠视网膜细胞凋亡过程中细胞内钙离子浓度的变化

目的观察H2O2诱导原代培养SD大鼠视网膜细胞凋亡过程中细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化及其来源。方法取1~3d内新生SD大鼠视网膜进行原代细胞培养,以100μmol/L H2O2作用0、2、4、8、12、24h,采用MTT法进行细胞活力检测,应用Hoechst 33342染色法进行细胞凋亡检测,以Fluo-3AM为细胞内Ca2+探针并利用荧光激活细胞分类技术(FACS)进行[Ca2+]i检测,确定H2O2诱导细胞损伤及凋亡过程中[Ca2+]i的变化;应用细胞外Ca2+螯合剂EGTA初步检测H2O2诱导的[Ca2+]i变化是否源于细胞外Ca2+内流。结果 100μmol/L H2O2可诱导原代培养的SD大鼠视网膜细胞发生凋亡,且凋亡数目呈时间依赖性递增;100μmol/L H2O2作用2~24h均可显著降低细胞活力,而[Ca2+]i的升高出现在H2O2作用2h且维持至12h,然后逐渐下降,至24h恢复至正常水平;0.5~5mmol/L EGTA可显著削弱由100μmol/L H2O2作用2h导致的[Ca2+]i增加。结论在H2O2诱导原代培养的SD大鼠视网膜细胞发生凋亡过程中,[Ca2+]i的升高发生在凋亡的早期阶段,而非细胞凋亡全过程中;H2O2的损伤作用所导致的[Ca2+]i升高部分来源于细胞外Ca2+的内流。     

PDGFR信号通路促进星形胶质细胞和成纤维细胞共培养时细胞簇的成团效应

目的探讨血小板衍生生长因子受体(PDGFR)信号通路对小鼠脑星形胶质细胞和成纤维细胞共培养体系增殖的影响。方法取出生1～3 d的小鼠乳鼠大脑皮质培养星形胶质细胞,取脑膜培养成纤维细胞,免疫细胞化学荧光染色胶质纤维酸性蛋白(GFAP)鉴定星形胶质细胞纯度,染色纤连蛋白(FN)鉴定成纤维细胞纯度。通过向小鼠脑星形胶质细胞和成纤维细胞共培养细胞体系中加入细胞因子血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)刺激细胞或抑制剂AG1296进行干预,观察各组细胞增殖情况,Western blot检测共培养细胞系中p-PDGFR-β、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)的表达变化。结果鉴定结果显示星形胶质细胞和成纤维细胞的细胞纯度达到90%。显微镜下观察显示,加入PDGF-BB后星形胶质细胞和成纤维细胞共培养体系增殖明显并形成团块,给予抑制剂AG1296则增殖受到抑制,团块明显减少。Western blot结果显示加入PDGF-BB时,p-PDGFRβ、p-Akt表达增多(P<0.01);给予抑制剂AG1296则表达减少(P<0.05)。结论 PDGFR信号通路促进体外小鼠脑星形胶质细胞和成纤维细胞的增殖。     

PC12细胞转染人GPx-1基因后的抗氧化损伤作用

目的探讨GPx-1高表达在H2O2介导的PC12细胞损伤时的保护作用及分子机制。方法将PC12细胞转染含人GPx-1基因的plncx质粒及空载体plncx质粒,经持续筛选建立起稳定表达人GPx-1基因和空质粒plncx的PC12细胞系。对PC12、GPx-1-PC12、plncx-PC12 3组细胞,分别给予H2O2和亚硒酸钠+H2O2干预方式,GPx活性检测试剂盒检测各组细胞GPx活性;MTT法检测细胞的存活情况;流式细胞仪检测细胞凋亡发生的情况;免疫细胞化学法观察NF-κBp65的表达情况。结果 GPx-1-PC12组细胞GPx活性较对照组明显增高;3组细胞分别给予2种干预后,PC12与plncx-PC12组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05),GPx-1-PC12较PC12、plncx-PC12组细胞存活率明显增高(P<0.01);GPx-1-PC12较PC12、plncx-PC12细胞早期和晚期凋亡率明显下降,存在统计学差异(P<0.01);GPx-1-PC12较PC12细胞NF-κBp65表达明显减少(P<0.01)。结论 GPx-1基因高表达对H2O2所致的PC12细胞氧化损伤有很好的保护作用;GPx-1可抑制PC12细胞氧化损伤时凋亡的发生及NF-κB的表达。     

黄芩苷对人牙周膜细胞RANKL-OPG表达的影响及其作用机制

目的 研究黄芩苷对人牙周膜细胞核因子-κB受体激活物配基和骨保护素(RANKL-OPG)表达的影响及其作用机制.方法 首先构建转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βⅡR)靶向siRNA真核表达载体,转染正常人外周血T细胞,使T细胞表面的TGF-βⅡR基因沉默,继而将转染与未转染靶向性TGF-βⅡR基因沉默的T细胞和正常人牙周膜成纤维细胞置于加有黄芩苷和内毒素的培养基中,分为6组:①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞.共培养48h,RT-PCR检测牙周膜细胞RANKL和OPG的表达,计算RANKL/OPG比值.结果 ①酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的 序列完全一致;②转染siRNA1的T细胞组的TGF-βⅡR mRNA的表达被明显抑制;③RANKL/OPG的比值在各组间的差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建了TGF-βⅡR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞;黄芩苷可以降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值;TGF-β的信号传导在黄芩苷影响牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG表达过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGF-β信号传导通路,而是亦通过其他通路对牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG进行调控.     

PPAR-γ通过活化PTEN抑制肾间质成纤维细胞MMP2的活化

目的探讨激活的PPAR-γ是否通过活化PTEN抑制血小板源性生长因子(PDGF)刺激的肾间质成纤维细胞MMP2活化,从而介导肾间质纤维化的发生。方法以原代分离培养的小鼠肾间质成纤维细胞为研究对象,以肾间质纤维化的主要刺激因子PDGF-AA刺激细胞。于PDGF-AA刺激细胞前,分别予以罗格列酮激活PPAR-γ,PI3K、PTEN、PPAR-γ特异性抑制剂LY294002、bpV(Pic)、GW9662预处理细胞,检测AKT、PTEN、PPAR-γ、MMP2的活化水平。结果成功分离并培养小鼠肾间质成纤维细胞,并证实PDGF-AA可剂量依赖性激活MMP2,而对MMP9、TIMPs无影响。特异性抑制PI3K/AKT信号通路或激活PPAR-γ显著抑制PDGF-AA刺激的AKT、MMP2活性;抑制PTEN可逆转PPAR-γ激活对PDGF-AA诱导的AKT磷酸化及MMP2活性的影响。结论 PI3K/AKT信号通路特异性介导PDGF-AA诱导的肾间质成纤维细胞MMP2的活化;激活的PPAR-γ通过活化PTEN抑制PI3K/AKT信号通路进而抑制MMP2活化。     

正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞DNA损伤的实验研究

目的研究正己烷(n-hexane)对大鼠的脂质过氧化作用和肝细胞DNA损伤的影响。方法40只雄性SD大鼠随机分成5组,即阴性对照组、75、150、300 mg/kg染毒组和阳性对照组,每组8只。经腹腔注射染毒4周后,检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力,血清还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量;用彗星试验技术(SCGE)检测大鼠肝细胞DNA的损伤。结果大鼠体重随染毒时间而增加,阴性对照组增加最快;随染毒剂量增加,肝组织匀浆中SOD、GSH-Px活力、血清GSH含量明显降低,而血清MDA含量增大,组间比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01);肝细胞SCGE检测彗星尾长、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩均增大,组间比较有显著性差异(P<0.01),尾矩值与染毒剂量作相关分析,相关系数r为0.981,呈正相关(P<0.05)。结论正己烷可引起或增强机体氧自由基反应,导致脂质过氧化损伤和肝细胞DNA损伤。     

DETECTION OF STRAND BREAKS OF DNA IN HUMAN EARLY CHORIONIC VILLUS CELLS INDUCED BY DIAGNOSTIC ULTRASOUND USING ^32P-LABELED ALU HYBRIDIZATION

Genetic effects of ultrasound on fetus havebeen extensively studied since ultrasonograph waswidely appliedin obstetric practice.In recent years,there have been reports onin vivomolecular geneticeffects of diagnostic ultrasound[1-4].In vitroexperi-ments have found that single-stranded breaks(ssbs)and double-stranded breaks(dsbs)in DNA are themain indices for DNA lesions induced by ultra-sound[5].But,no reports on whether ultrasound cancausein vivossbs and dsbs in DNAare available.Tofurther …     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

THE CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-3 GENE

Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ－３）ｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｆａｍｉｌｙｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｙｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ〔１〕．Ｔｈｅｇｅｎｅｏｆｈｕｍａｎｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ｈＮＴ－３）ｉｓｌｏｃａ...     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

葎草花粉主要变应原核酸疫苗pcDNA3.1-LC2的真核细胞表达和免疫分析

目的 验证葎草花粉主要变应原核酸疫苗(pcDNA3.1-LC2)能否在真核细胞内表达,并进行免疫原性、免疫保护作用、安全性等分析.方法 应用磷酸钙沉淀法将pcDNA3.1-LC2转染至HEK293细胞,提取RNA并行RT-PCR,利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,验证所分离出的条带与目的 片段是否一致;应用pcDNA3...     

内脂素基因多态性与2型糖尿病的关系

目的探讨内脂素(visfatin)rs11977021、rs12537455、rs2110385位点单核苷酸多态性与2型糖尿病易感性的关系。方法收集陕西西安地区汉族人群192例受试对象,其中106例单纯2型糖尿病(T2DM)患者和86例健康对照者,采用标准化的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RLFP)方法,分别检测内脂素(visfatin)rs11977021/DdeⅠ、rs12537455/AluⅠ和rs2110385/AluⅠ基因型并进行比较。结果 rs2110385位点的T等位基因频率和GT基因型频率在T2DM组均高于健康对照组(分别为28.3、14.0和14.2、7.0,P均<0.05);两组的rs11977021位点和rs12537455位点C、T等位基因及基因型频率分布均无统计学差异(P>0.05);单倍型分析显示T-C-T和T-T-T单倍型在T2DM组均显著高于健康对照组(分别为0.066、0.026和0.029、0.012,P均<0.05)。结论 Visfatin基因rs2110385位点在陕西西安汉族地区人群中存在遗传变异,其rs2110385多态性位点的T等位基因可能与T2DM的发病风险有一定的关系。     

ENHANCEMENT OF DNA SYNTHESIS IN CULTURED ADULT RAT HEPATOCYTES BY 5-HT THROUGH STIMULATION OF 5-HT2 RECEPTOR

Ａｌｔｈｏｕｇｈａｄｕｌｔｍａｍｍａｌｉａｎｈｅｐａｔｏ－ｃｙｔｅｓａｒｅｈｉｇｈｌｙｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄａｎｄｎｏｎｐｒｏ－ｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｓ,ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆａｄｕｌｔｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｃａｎｂｅ...     

亚硒酸钠对小鼠脾细胞DNA合成的影响

本文通过1次和多次给小鼠不同剂量的亚硒酸钠,以~3H-TdR掺入脾细胞DNA为指标,同时进行全血硒浓度测定,观察了补硒对小鼠体内细胞DNA合成的影响以及与血硒浓度的关系。结果表明:①亚硒酸钠对脾细胞DNA合成呈双相作用,低剂量促进其合成,高剂量则产生毒性抑制作用,毒性作用短暂、可逆,与1次大剂量有关。②多次给硒,最终血硒浓度与毒性作用之间不呈正相关。③补硒的单次剂量和方式影响稳态血硒浓度水平。