重组人突变型471TNF-α及野生型TNF-α的表达及活性初步鉴定

目的　采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法　采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,转入大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达野生型及突变型 471TNF α蛋白。初步纯化蛋白后 ,采用MTT法评估两者对L92 9细胞的杀伤作用。结果　①获得了测序正确的野生型TNF α及突变型 471TNF α的cDNA克隆 ;②构建了正常人野生型TNF α及突变型 471TNF α重组表达质粒 ;③经温度诱导 ,TNF α及突变型 471TNF α蛋白均获得了表达 ;④初步的生物学活性研究表明 ,突变型 471TNF α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论　突变型 471TNF α的生物学活性优于野生型TNF α ,为进一步开展TNF α的基础及临床研究奠定了基础     

STUDY OF ECK GENE EXON-3 FROM HUMAN NORMAL TISSUE AND BREAST CANCER CELL LINE

ECK (epithelialcellkinase) ,alsonamedasEphA 2 ,isoneofthemembersofEphAsubfamilyinEphfamily .ECK protein ,atransmembranety rosinekinase[1] ,canbestructurallydividedintothreedomainsaccordingtotheirpositionsincells.ThreedomainsareexternaldomainwithanN ter minalsignalpeptide ,atransmembranedomainandacytoplasmicdomainwhichincludesacanonicalpro tein tyrosinekinasecatalyticdomain .ECKiswide lyexpressedinavarietyofhumantissues ,abun dantly presentinlung ,skin ,smallintestineandovary .ECKisalsoe…     

细胞周期素E与甲状腺肿瘤的关系

目的　检测甲状腺肿瘤组织中CyclinE和PCNA的表达 ,探讨CyclinE与肿瘤发生及恶性程度的关系。方法　利用免疫组织化学技术分析 17例甲状腺腺瘤、43例甲状腺癌及 19例瘤旁“正常”组织中的CyclinE及PCNA的表达。结果　CyclinE及PCNA在“正常”组织与甲状腺腺瘤组织中表达无显著性差异 ;CyclinE及PCNA在甲状腺癌中的表达显著高于“正常”组织和甲状腺腺瘤组织 ,且随肿瘤恶性程度的增加而增加 ;CyclinE和PCNA的表达在“正常”组织、甲状腺腺瘤和甲状腺癌组织中均呈正相关。结论　CyclinE的表达可以作为诊断甲状腺癌及预测肿瘤恶性程度的指标。     

重组人突变型471TNF—α及野生型TNF—α表达及活性初步鉴定

目的 采用原核表达系统，表达人突变型471TNF－α蛋白，并检测其生物学活性。方法 采用PCR技术扩增突变型471TNF－α及野生型TNF－α cDNA片段，克隆入中间载体pUCm-T中，并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段，克隆入pBV220中，转入大肠杆菌DH5α，温度诱导表达野生型及突变型471TNF－α蛋白。初步纯化蛋白后，采用MTT法评估两者对L929细胞的杀伤作用。结果 ①获得了测序正确的野生型TNF－α及突变型471TNF－α的cDNA克隆；②构建了正常人野生型TNF－α及突变型471TNF－α重组表达质粒；③经温度诱导，TNF－α及突变型471TNF－α蛋白均获得了表达；④初步的生物学活性研究表明，突变型471TNF-α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论 突变型471-α的生物学活性优于野生型TNF－α，为进一步开展TNF－α的基础及临床研究奠定了基础。     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

突变型人肿瘤坏死因子-α工程菌发酵培养的实验研究

目的　优化基因重组人突变型 4 71肿瘤坏死因子 α(TNF α)工程菌的发酵和表达条件。方法　通过改变培养基的组分、pH值、培养温度和诱导表达的条件等 ,采用测定细菌生物量和蛋白表达量等方法 ,确定最适的发酵和表达条件 ,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果　突变型 4 71rhTNF α工程菌在 pH值 7.5的SOC培养基中 ,30℃培养、4 2℃诱导 5h时 ,其表达量最大。而且 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,目的蛋白的表达不受影响。结论　优化了基因重组人突变型 4 71rhTNF α工程菌的发酵和表达的最适条件 ,为进一步开发人突变型 4 71rhTNF α奠定了基础