两种实时定量RT-PCR方法检测miRNAs表达的技术分析

目的比较两种实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测microRNAs(miRNAs)表达含量的技术差异,优化不同实验目的和条件下研究miRNAs表达的技术方法。方法取21d和42d两个时间点的SD大鼠关节软骨组织,采用Trizol法提取总RNA备用。选取rno-miR-15b、rno-miR-16、rno-miR-195、rno-miR-497作为研究对象,分别用茎环引物和试剂公司提供的试剂盒方法反转录总RNA,并应用实时定量PCR方法检测这些miRNAs的表达量。提取人血浆中总RNA,用上述两种RT-qPCR方法实时定量检测has-miR-16的表达量。结果两种方法检测这些miRNAs表达量,在大鼠21d和42d这两个时间点其表达量变化趋势相同,都呈现增高的趋势,这与我们前期Solexa测序结果相同。在血浆中的结果显示,其中茎环引物反转录方法灵敏度相对较高。结论茎环引物法在少量几个重要的miRNAs检测中具有优势,而试剂盒方法适用于大量miRNAs的筛查。     

大鼠海马组织RNA、DNA和蛋白质共提取方法的研究

目的探讨Trizol法同时提取大鼠单侧海马组织RNA、基因组DNA和蛋白质的可行性及优势。方法 Trizol法提取成年雄性Sprague-Dawley大鼠单侧海马组织RNA、基因组DNA以及蛋白质;商业化试剂盒提取另一侧海马组织基因组DNA,RIPA裂解液提取蛋白质。用超微量分光光度计和SYBR实时定量RT-PCR法检测Trizol法提取的RNA的质量,利用超微量分光光度计和聚合酶链式反应(PCR)法比较两种方法提取DNA的效果及质量,采用Western blot法比较两种方法提取蛋白质的效果。结果 Trizol法提取单侧海马RNA的质量浓度介于1 178.3² 225.8ng/μL之间,A260/280介于2.012 225.8ng/μL之间,A260/280介于2.01².03,A260/230介于1.882.03,A260/230介于1.88².22,并获得了稳定的β-actin和GR循环域值。Trizol法和试剂盒提取单侧海马DNA的质量浓度分别介于215.72.22,并获得了稳定的β-actin和GR循环域值。Trizol法和试剂盒提取单侧海马DNA的质量浓度分别介于215.7²71.8ng/μL和268.6271.8ng/μL和268.6⁸72.5ng/μL之间,均适于充当PCR反应模板。Trizol法和RIPA裂解液提取的蛋白质在Western blot法检测目的蛋白含量的过程中均呈现清晰的条带。结论 Trizol法提取大鼠单侧海马组织RNA的同时提取的DNA和蛋白质,与商业化试剂盒和RIPA裂解液从不同海马组织中分别提取基因组DNA和蛋白质的效果相当。采用Trizol法同时提取海马组织的RNA、DNA和蛋白质,不仅提高了实验效率、节约了实验成本,而且有效避免了因反复实验操作带来的人为干扰及误差。     

低压低氧暴露条件下肺动脉高压大鼠循环microRNA表达及其意义

目的研究低压低氧暴露条件下肺动脉高压(HPH)模型大鼠循环microRNA(miRNA)表达的变化。方法利用基因芯片技术定量检测、分析HPH组及对照组大鼠血清中潜在的循环miRNA的表达及其差异。基于病例-对照设计,采用荧光定量PCR技术对差异化表达miRNA进行验证。受试者工作特征曲线(ROC)分析测试4种差异化表达miRNA对HPH组及对照组的鉴别效能。结果与对照组比较,HPH组大鼠13种miRNA表达上调,10种miRNA表达下调,其中,荧光定量PCR初步证实miR-451、miR-505及let-7d表达上调,而miR-214表达下调。ROC分析结果显示,miR-451、miR-505及let-7d用于鉴别HPH组大鼠和对照组大鼠的曲线下面积(AUC)分别为0.979、0.938和0.993。结论低压低氧暴露条件下HPH组大鼠与对照组大鼠循环miRNA的表达存在显著差异,提示血清miRNA差异化表达可能与HPH病理变化相关。     

miR-125a-3p和miR-17-5p在激素性股骨头坏死中的作用

目的探讨激素性股骨头坏死中miRNA的差异性表达变化。方法取激素性股骨头坏死的坏死区域骨组织为实验组,其股骨颈基底部骨组织为对照组;分别提取总RNA并进行质检;采用miRNA芯片技术检测miRNAs的表达并对其表达谱进行分析;运用实时定量PCR对差异明显的miR-125a-3p和miR-17-5p进行验证。结果对激素性股骨头坏死中miRNA表达谱进行差异性分析。和对照组相比,实验组中倍数大于2倍,P<0.05的miRNA共有11个。8个miRNA表达上调,3个表达下调。实时定量PCR证实miR-125a-3p在坏死标本中高表达,而miR-17-5p呈现低表达,与miRNA芯片结果一致。结论激素性股骨头坏死区域骨组织与对照组相比miRNAs表达发生明显变化,以miR-125a-3p和miR-17-5p差异最为明显。这表明了它们最有可能参与了激素性股骨头坏死病理过程的调控。     

改良HCV RT-PCR方法及产物的SSCP分析

传统的RT－PCR方法，要对模板RNA进行提取和纯化，以除去RNA酶和其它杂质，而且要对可能存在的RNA酶进行抑制，防止模板RNA被降解[1]。而在PCR扩增时，用一对引物反转录和扩增的特异性并不高，因此大都采用套式PCR，以获得特异性好的PCR产物。这就使得实验成本增高，耗费时间，同时也给SSCP分析带来很大不便。因为在进行PCR产物的SSCP分析时，产物的特异性要高，即电泳条带要窄、要亮，这样SSCP分析结果才可靠”’。我们采用改良的SIOZ吸附法从血清中提取HCVRNA，并用一对引物对HCVRNAC区进行RT－PCR扩增，获得了…     

改良HCV RT-PCR方法及产物的SSCP分析

传统的RT－PCR方法，要对模板RNA进行提取和纯化，以除去RNA酶和其它杂质，而且要对可能存在的RNA酶进行抑制，防止模板RNA被降解[1]。而在PCR扩增时，用一对引物反转录和扩增的特异性并不高，因此大都采用套式PCR，以获得特异性好的PCR产物。这就使得实验成本增高，耗费时间，同时也给SSCP分析带来很大不便。因为在进行PCR产物的SSCP分析时，产物的特异性要高，即电泳条带要窄、要亮，这样SSCP分析结果才可靠”’。我们采用改良的SIOZ吸附法从血清中提取HCVRNA，并用一对引物对HCVRNAC区进行RT－PCR扩增，获得了…     

miR-195表达载体构建及其对肝癌细胞株HepG2植瘤抑制效果的影响

目的研究miR-195对人肝癌细胞株HepG2肿瘤形成的影响。方法应用分子克隆技术构建miR-195表达载体;用脂质体转染以及克隆筛选技术,建立miR-195高表达HepG2细胞株,并通过测序及序列比对等进行鉴定;建立荷瘤小鼠模型,检测不同细胞系的肿瘤生长能力。结果通过测序及序列比对,证明miR-195表达载体构建成功;荧光显微镜观察结果显示,miR-195高表达HepG2细胞株成功构建,实时定量PCR鉴定结果表明,构建的miR-195高表达HepG2细胞株miR-195表达量为对照培养HepG2细胞株的2 000倍(P<0.01);植瘤实验证明,miR-195高表达可以抑制肿瘤的形成过程。结论作为抑癌的miRNA,miR-195有望成为肝癌基因治疗的效应分子。     

三阴性乳腺癌差异表达miRNA的筛选

目的应用miRNA芯片技术筛选三阴性乳腺癌及癌旁组织差异表达的miRNAs,为进一步阐明其在三阴性乳腺癌发病机制中的作用奠定基础。方法收集8例新鲜的三阴性乳腺癌及其癌旁组织,抽提总RNA进行Hy3荧光标记,miRCURYTMLNA Array(v.16.0)(Exiqon)芯片上进行杂交反应,实时定量PCR验证miRNAs芯片结果的可靠性。结果对芯片进行图像扫描和数据分析,筛选获得17个三阴性乳腺癌相关miRNAs,其中7个miRNAs表达上调,10个miRNAs表达下调;显著上调的有miR-93、miR-328,显著下调的有miR-145、miR-205。结论筛选得到三阴性乳腺癌miRNA差异表达谱,其可能与三阴性乳腺癌的发生发展有关。     

脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.     

2型糖尿病患者肠道乳酸菌属和消化链球菌属定量研究及其意义

目的对2型糖尿病患者与健康人肠道乳酸菌属和消化链球菌属进行定量分析,探讨两组人群肠道菌群的差异。方法提取肠道菌群总DNA,利用菌属特异性引物实时荧光定量PCR扩增,制作菌属标准品和标准曲线,定量分析两种优势菌属在糖尿病患者和健康人群中的含量。结果与健康对照组相比,2型糖尿病组肠道消化链球菌的数量均显著减少,而乳酸菌属的数量两组间无统计学差异。结论荧光定量PCR方法可作为研究肠道菌群的一种准确、敏感的检测方法;糖尿病患者肠道优势菌属发生变化,提示肠道优势菌群可能与糖尿病的发生发展有一定的相关性。     

为部队训练研发浮动目标靶等新装具的回忆

在内陆地区借助专用装具模拟海上浮动目标进行射击训练,从而有效地提高现役部队官兵和预备役指战员的实战技能。浮动靶标的研发成功地实现了这一预想。     

水泥粉煤灰稳定碎石合理级配分析

提出了粉煤灰改善混合料结构的理念,通过替代细集料的方式对3种不同级配设计的水泥粉煤灰稳定碎石混合料试验,研究分析表明:级配1混合料形成了较大程度的嵌挤密实结构,最大干密度和无侧限抗压强度最大,而采用了骨架密实结构的级配2混合料形成了不密实的多孔结构,最大干密度和无侧限抗压强度最低,悬浮密实型的级配3混合料最大干密度和无侧限抗压强度略低于级配1。     

利用MAS实现车辆动态识别与智能跟踪

针对视频图像车辆智能跟踪问题,提出了利用帧间差异积累动态矩阵进行自适应背景建模算法,采用背景差提取运动目标区域,设计了一种基于知识的多Agent智能系统进行目标分割、轮廓提取和空域滤波,增强了抗背景干扰能力,使获得的目标区域具有更好的空域连通特性;通过自适应核窗宽改进了MeanShift算法的收敛速度,利用SSD算法实现了快速初始定位。实验结果表明,该方法自治能力强,跟踪目标快速准确,实时有效。     

沥青路面常见病害的防治和相应设备使用工艺

沥青混凝土路面是当前道路的主要形式,基于工程实践,对其常见病害的产生机理进行分析,从而提出处理这些病害的工艺及适用设备。     

浅议影响汽车综合性能检测结果的几个因素

简述了汽车综合性能检测中影响检测结果5个方面的因素,提出了公司为保证检测结果的公正性、科学性而采取的措施。     

监控量测技术在长逢沟隧道施工中的应用与数据分析

长逢沟隧道为一座左、右线分离的四车道高速公路长隧道,地质情况复杂,围岩软弱破碎,总体较差,Ⅲ级围岩仅占32.86%,Ⅳ、Ⅴ级围岩占67.14%,且穿越3个大断裂带,埋深较浅.根据新奥法施工原理及隧道施工实际情况,在施工过程中严格地、系统地采用监控量测技术指导施工,以现场监控的围岩观察、拱顶下沉、水平收敛、地表下沉等数据...     

王繁高速公路太安岭隧道涌水量预测与评价

以太安岭隧道为例,利用地下水动力学方法对隧道开挖的涌水量进行了预测,预测结果表明,隧道全线属于弱富水段,根据预测结果提出了隧道施工建议。     

水泥稳定冷再生材料路用性能试验研究

通过室内试验对水泥稳定冷再生混合料的无侧限抗压强度、抗压回弹模量、劈裂强度、抗冻性能进行了系统的研究,同时研究了水泥剂量、旧料掺加比例、温度对水泥稳定再生混合料的影响.研究表明,水泥剂量为5%时,冷再生材料的强度和其他路用性能指标均满足规范的要求.     

水泥稳定碎石配合比设计方法的研究

水泥稳定碎石在我国公路工程中有着广泛的应用,对比分析了两种不同的水泥稳定碎石配合比设计方法,以成型原理、试件最大干密度、试件强度为切入点,充分证明了室内采用振动压实法对提高半刚性基层的路用性能有明显的作用,最后结合试验路工程,总结了水泥稳定碎石振动压实法的施工工艺。     

某岩质边坡失稳机理分析及处置措施研究

通过对现场失稳岩质边坡的调查,简述了边坡存在的隐患,对其进行了失稳机理分析,根据工程特点设定了治理目标及治理方案,并简要阐述了施工工程布置方案,对类似的工程有一定的指导作用。