含人谷胱苷肽过氧化物酶基因重组腺病毒的构建

目的构建含人谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)基因的重组腺病毒载体,为基因治疗提供一种新的方法。方法从人血中分离出白细胞,提取总RNA,采用RT-PCR法获得人GPx-1和人GPx-2的全长cDNA,克隆到pcD-NA3.1+中,构建pcDNA3.1+GPx-1和pcDNA3.1+GPx-2载体,酶切和基因测序鉴定阳性克隆;采用酶切法把GPx-1和GPx-2基因克隆至入门载体pENTR1A中,构建pENTR1A-GPx-1和pENTR1A-GPx-2载体。采用LR反应,体外重组pENTR1A-GPx-1或pENTR1A-GPx-2和pAd/CMV/V5-DEST,得重组腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST-GPx-1和pAd/CMV/V5-DEST-GPx-2。PCR和序列测定鉴定重组腺病毒载体。293A细胞中包装和扩增GSH-Px-1和GSH-Px-2的重组腺病毒。结果获得GSH-Px-1和GSH-Px-2的重组腺病毒载体和重组腺病毒。结论成功构建了pAd/CMV/V5-DEST-GPx-1和pAd/CMV/V5-DEST-GPx-2重组腺病毒载体,并在293A中获得该重组腺病毒,为进一步研究人GSH-Px基因在基因治疗中的作用奠定了基础。     

尿毒症及肾病综合征患者血清蛋白电泳的变化

本文对50例尿毒症患者血清进行聚丙酰胺凝胶电泳,结果表明其α~-脂蛋白、部分α_1~-和α_2~-球蛋白明显下降,触珠蛋白、β-脂蛋白明显上升。同时对50例肾病综合征患者血清进行上述电泳,结果表明其白蛋白、部分α_1~-和α_2~-球蛋白明显下降,部分β_2-球蛋白及β-脂蛋白明显上升。对上述变化的机理及临床意义也进行了探讨。     

利用TRIzol(R)试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA

目的 建立胰腺高质量总RNA快速、经济、稳定的提取方法.方法 应用TRIzol(R)试剂和液氮提取大鼠胰腺总RNA,通过总RNA含量和A260/280比值的测定及10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳评估总RNA的质量,并用RT-PCR检测大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α-淀粉酶和β-actin的表达.结果 利用TRIzol(R)和液氮提取的大鼠胰腺总RNA量可达到3～6μg/mg胰腺组织,A260/280比值在1.75～1.89之间.在10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时,均可见28S及18S条带,并且在28S、18S条带间可见明显的云雾状阴影.大鼠胰岛素1、胰高血糖素、胰α-淀粉酶、β-actin RT-PCR产物电泳结果显示均有清晰的条带.结论 应用TRIzol(R)试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总RNA,后者可用于RT-PCR研究.     

一种从血浆及血清中提取循环microRNA的方法

目的提取和检测血浆和血清中的循环microRNA(miRNA)分子。方法使用TRI REAGENT?BD试剂盒提取血浆和血清中的总RNA分子后,运用非变性凝胶电泳方法进行检测。随后采用miRNA反转录试剂盒反转录miRNA的cDNA分子,并使用实时定量荧光PCR方法检测miRNA分子。结果成功提取和检测到了血浆和血清中的总RNA,同时实时定量荧光PCR方法检测出血浆和血清中的循环miRNA分子。结论成功提取和检测到血浆和血清中的循环miRNA,并可用于实时定量PCR实验,为进一步的miRNA的理论研究和临床应用奠定了一定的实验基础。     

小反应体积实时定量PCR的可行性评价

目的 从扩增稳定性、扩增效率以及可靠性等多方面评估实时定量PCR(RtPCR)反应小体积的可行性,同时确定适合小体积体系的模板量.方法 将实验分为10、15、20μL 3个体积组,每组分别采用0.1、0.2、0.3、0.4μL的大鼠cDNA为模板,进行大鼠β-actin mRNA的RtPCR扩增.通过扩增曲线和熔解曲线考察反应的稳定性,以梯度模板拟合标准曲线获得反应的扩增效率,其线性相关程度反映模板量是否合适.另外,构建大鼠降植烷诱导的关节炎(pristane-induced arthritis, PIA)模型,采用选定的反应体系,分别对模型组和正常组大鼠脾脏TNF-α mRNA进行扩增,通过TNF-α的相对表达趋势反映小体积扩增的可靠性.结果 在大鼠β-actin mRNA的RtPCR扩增中,10、15、20μL 3个体积组均能特异稳定地进行扩增,并保证高扩增效率.而且每个体积组中的模板梯度表现出很好的线性相关趋势.同时选用10μL和20μL反应体积、0.2μL模板对关节炎大鼠脾脏进行TNF-α mRNA扩增,结果一致表现出了预期的显著性上调.结论 实验证实10μL、15μL等小反应体积应用于RtPCR扩增中是可行的,具有较好的稳定性和可靠性,同时0.1～0.4μL cDNA模板在3种体系的合适模板范围内.这种较小的PCR反应体积,不仅节省了试剂和实验材料,对一些来之不易的临床标本尤为重要,也利于高通量大规模的RtPCR检测的实现.     

两种实时定量RT-PCR方法检测miRNAs表达的技术分析

目的比较两种实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测microRNAs(miRNAs)表达含量的技术差异,优化不同实验目的和条件下研究miRNAs表达的技术方法。方法取21d和42d两个时间点的SD大鼠关节软骨组织,采用Trizol法提取总RNA备用。选取rno-miR-15b、rno-miR-16、rno-miR-195、rno-miR-497作为研究对象,分别用茎环引物和试剂公司提供的试剂盒方法反转录总RNA,并应用实时定量PCR方法检测这些miRNAs的表达量。提取人血浆中总RNA,用上述两种RT-qPCR方法实时定量检测has-miR-16的表达量。结果两种方法检测这些miRNAs表达量,在大鼠21d和42d这两个时间点其表达量变化趋势相同,都呈现增高的趋势,这与我们前期Solexa测序结果相同。在血浆中的结果显示,其中茎环引物反转录方法灵敏度相对较高。结论茎环引物法在少量几个重要的miRNAs检测中具有优势,而试剂盒方法适用于大量miRNAs的筛查。     

G蛋白偶联的内整流型钾通道在哮喘模型大鼠肺组织的表达

目的检测G蛋白偶联的内整流钾通道(G protein-coupled inwardly rectifying potassium channels,GIRK)在哮喘模型中的表达改变,并寻找调节其表达变化的因素。方法用卵清蛋白和铝佐剂致敏E3大鼠14d后,用卵清蛋白进行攻击以诱导哮喘模型,用磷酸盐缓冲液致敏并攻击的大鼠作为对照,通过观察肺组织病变、总IgE水平的改变等手段评价哮喘模型。用RT-PCR检测GIRK亚基1~4的mRNA水平,用Western blot等手段检测大鼠肺组织中GIRK1和GIRK3的蛋白水平,并用免疫组化确定肺组织中GIRK表达的解剖部位。根据免疫组化的结果,选用A549细胞株作为模型,用IL-4刺激,用PCR、Western blot等手段检测IL-4对GIRK表达的影响。结果与对照组相比,哮喘模型组肺组织中GIRK的mRNA水平下降,哮喘模型组肺组织中GIRK蛋白水平也下降。免疫组化结果显示,GIRK在大鼠主要表达于气道上皮。随IL-4浓度的升高,在A549细胞中GIRK的所有的亚基的表达均呈剂量依赖性下降趋势;选择50ng/mL IL-4刺激A549细胞,GIRK的所有的亚基的表达均呈刺激时间依赖性的下降。结论在E3大鼠哮喘模型中,IL-4下调气道上皮中GIRK的表达。     

中国汉族男性人群D-氨基酸氧化酶激活剂基因多态性与精神分裂症的关联研究

目的 研究中国男性群体中D-氨基酸氧化酶激活剂(DAOA)基因多态性与精神分裂症的相关性.方法 采用等位基因特性PCR方法对272例男性精神分裂症患者和206例对照DAOA基因区域的3个单核苷酸多态性位点(SNP:rs778294,rs778293和rs3918342)进行基因分型和统计分析.结果 DAOA基因区域rs778294的一个等位基因(C)与精神分裂症显著相关(P=0.03).由3个SNP构建的单倍型分析表明,单倍型CAT在病例-对照组中表现出显著的差异.结论 在中国汉族男性群体中,DAOA基因可能是精神分裂症的一个易感基因,NMDA受体途径可能是发生精神分裂症的一个重要潜在因素.     

大鼠肝脏干细胞的胰十二指肠同源盒基因表达系的构建与初步鉴定

目的 建立大鼠肝脏干细胞的Pdx-1基因表达系.方法 逆行穿刺SD大鼠乳鼠肝脏门静脉,经胶原酶Ⅳ消化并分离肝脏干细胞;免疫组织化学鉴定大鼠肝脏干细胞标志物细胞角蛋白18/19、甲胎蛋白的表达;构建pEGFP-Pdx-1表达载体并酶切鉴定,用脂质体2000介导表达载体转染大鼠肝脏干细胞后,荧光显微镜观察GFP表达,免疫组织化学鉴定Pdx-1的表达.结果 肝脏门静脉逆行穿刺分离培养大鼠肝脏干细胞具有分裂增殖能力、角蛋白18/19、甲胎蛋白表达阳性;pEGFP-Pdx-1表达载体转染后的肝脏干细胞可表达绿色荧光蛋白报告基因和Pdx-1蛋白.结论 成功建立了大鼠肝脏干细胞Pdx-1表达系.     

KCNE2蛋白在自发性高血压大鼠心脏组织中的分布和表达

目的研究KCNE2蛋白在自发性高血压大鼠(SHR)心脏不同部位的分布和表达差异,及鼠龄对其表达水平的影响。方法提取幼龄和高龄SHR心肌不同部位(心室、室隔膜和心房)组织的膜蛋白,利用Western印迹技术和图象分析方法,比较KCNE2蛋白在样品之间免疫强度差异。结果SHR心肌不同部位组织中均有KCNE2蛋白的分布;同龄大鼠心肌不同部位组织中KCNE2蛋白的表达均无显著性差异;但在高龄大鼠的右心室和室隔膜组织中,KCNE2蛋白的表达显著高于其在幼龄大鼠相同组织中的表达。结论KCNE2蛋白在SHR心脏不同部位均有分布;在高龄大鼠右心室和室隔膜组织中,KCNE2蛋白的表达水平均高于其在幼龄大鼠同一组织中的表达。