抗人CD3单链抗体四聚体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　将抗人CD3单链抗体 (scFv) /人 p5 3四聚功能域融合基因转染到HeLa细胞 ,进行真核表达和活性测定。方法　将抗人CD3scFv /人 p5 3四聚功能域融合基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,转染HeLa细胞进行表达 ,表达产物纯化后利用流式细胞仪进行活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Westernblot证实 ,为Mr约35 0 0 0的特异蛋白条带。纯化后经流式细胞仪检测 ,可特异性地结合人外周血单个核细胞 (PBMCs) ,亲和力高于scFv。结论　获得了可与PBMCs特异性结合的抗人CD3scFv四聚体 ,为进一步临床应用奠定了基础     

重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL一12)的构建和真核表达

目的克隆人IL-12(hIL-12)p40和p35亚单位cDNA,构建人单链IL-12(rhscIL-12)融合基因,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经PDBu刺激的EBV转化的人B淋巴母细胞株NC37中提取mRNA,经RT-PCR分别获得hIL-12p40和p35亚单位编码序列的cDNA,运用重组PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头(Gly4Ser)3DNA序列进行体外基因重组,构建rhscIL-12融合基因,将其插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经脂质体转染COS7细胞进行表达,Westernb1ot进行分析。结果所克隆的hIL-12p40、p35cDNA序列和构建的rhscIL-12融合基因DNA序列均经测序得以证实,融合基因可在COS7中表达其产物rhscIL-12融合蛋白,其分子量为70KD,可与鼠抗人IL-12p40/p70单克隆抗体特异性结合。结论本研究结果为进一步探讨rhscIL-12融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础,也为rhscIL-12融合基因在原核细胞中的表达提供了可能性。     

B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性

目的　真核表达B7.1细胞外编码区以研究其生物学活性。方法　电穿孔法将重组质粒pDisplay/B7.1(V +C)导入人子宫颈癌细胞株 ,免疫组化及核酸原位杂交法分别检测其蛋白及mRNA表达 ,3 H TdR掺入法测定表达物对T细胞的刺激作用 ;MTT法研究转染细胞 T细胞混合培养引发的细胞毒性杀伤作用。结果　B7.1细胞外区在Hela细胞表面表达 ,所表达的B7.1细胞外区在抗CD3单抗存在的情况下具有刺激T细胞活化的特性 ,重组质粒转染的Hela细胞与T细胞混合培养可引起细胞毒性杀伤。结论　真核表达的B7.1(V +C)具有T细胞共刺激活性 ,可用于构建肿瘤免疫治疗之双功能分子。     

重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL-12)的构建和真核表达

克隆人 IL - 1 2 ( h IL - 1 2 ) p40和 p35亚单位 c DNA,构建人单链 IL- 1 2 ( rhsc IL- 1 2 )融合基因 ,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法　从经 PDBu刺激的 EBV转化的人 B淋巴母细胞株 NC37中提取 m RNA,经 RT- PCR分别获得 h IL- 1 2 p40和 p35亚单位编码序列的 c DNA,运用重组 PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头 ( Gly4 Ser) 3 DNA序列进行体外基因重组 ,构建 rhsc IL- 1 2融合基因 ,将其插入 pc DNA3.1 ( + )真核表达载体 ,经脂质体转染 COS7细胞进行表达 ,Western blot进行分析。结果　所克隆的 h IL- 1 2 p40、p35c DNA序列和构建的 rhsc IL - 1 2融合基因 DNA序列均经测序得以证实 ,融合基因可在 COS7中表达其产物 rhsc IL- 1 2融合蛋白 ,其分子量为 70 KD,可与鼠抗人 IL - 1 2 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论　本研究结果为进一步探讨 rhsc IL- 1 2融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础 ,也为 rhsc IL- 1 2融合基因在原核细胞中的表达提供了可能性     

抗人精浆蛋白单链抗体基因在HeLa细胞中的表达和活性鉴定

目的　在HeLa细胞中表达抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单链抗体 (scFv)基因 ,并进行亲和活性测定。方法　在已经构建抗人γ SmscFv基因基础上 ,将基因克隆入真核分泌表达载体 pSecTag2 B中 ,并转染HeLa细胞进行表达。表达产物纯化后 ,用流式细胞仪进行亲和活性测定。结果　表达产物经SDS PAGE和Western印迹实验证实为约30ku的特异蛋白条带 ,纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC 3细胞。结论　获得了可与PC 3细胞特异结合的抗人γ SmscFv ,为进一步临床应用奠定基础     

脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.     

SLC-Her-2/neu-p53-Fc融合基因重组腺病毒真核表达载体对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果

目的扩增纯化携带融合基因SLC-Her-2/neu-p53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体,研究其对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果。方法将重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc在人胚肾293细胞中扩增、纯化;向小鼠皮下注射表达Her-2/neu-p53融合基因的B16F10-psig-Her-2/neu-p53细胞(B16-HP细胞)建立荷黑色素瘤小鼠模型;将小鼠随机分成对照组、肌肉注射组和皮下注射组,用重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体进行治疗,观察肿瘤生长情况,测定细胞毒性活性、血清p53抗体。结果纯化后重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体滴度8×108pfu/mL。目的基因SLC-HP在小鼠体内成功表达。重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能有效抑制小鼠肿瘤的生长,瘤重与对照组比较差异有统计学意义(P=0.005),抑瘤率达到98.8%,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤力有明显提高。结论重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能延长出瘤时间,抑制肿瘤的生长。     

迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因的构建、表达及鉴定

目的 构建、表达及鉴定迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因.方法 采用RT-PCR方法从分泌迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1E11)中克隆出V_H和V_L可变区基因, 再通过重叠延伸拼接PCR方法在V_H和V_L可变区基因之间引入连接肽(Gly_4ser)_3,体外构建单链抗体基因;将其克隆至表达载体pET-28a并在大肠杆菌中表达,表达产物纯化后,用SDS- PAGE、Western blot及ELASA进行鉴定.结果 迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv在BL21(DE3)菌中获得表达,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体、纯化和体外复性,获得了高纯度的单链抗体片段,重组蛋白的分子质量为27 ku.ELASA分析结果证实迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力.结论 成功构建了迟缓爱德华菌抗独特型单链抗体基因scFv,为进一步制备迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定基础.     

新型抗ErbB2、抗CD16三价双特异性抗体的构建及功能鉴定

目的构建一种新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb。方法构建重组载体pET22b( )/BsAb;转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组蛋白的表达,通过包涵体复性纯化蛋白。应用悬浮培养系统扩增稳定表达抗人CD16 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(CG5细胞)和稳定表达抗人ErbB2 scFv-Fc融合蛋白的CHO细胞株(HG2细胞),通过rProtein A Sepharose Fast Flow亲和层析柱纯化融合蛋白,应用流式细胞术分析BsAb的结合能力。结果该BsAb可在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达,通过对重组蛋白的复性可获得高纯度的蛋白;复性后的BsAb具有与其亲本抗体相似性的结合靶抗原的能力。结论新型三价抗ErbB2、抗CD16 BsAb能与高表达ErbB2的乳腺癌细胞系SKBR3细胞高亲和力结合和表达CD16的人外周血单个核细胞低亲和力结合。     

DESIGN OF ANTI-CD3 ScFv-B7.1 FUSION MOLECULE AND PREDICTION OF ITS BIOLOGICAL CHARACTERISTICS

Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓｈａｖｅｓｈｏｗｎ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓｉｎｔｕｍｏｒｃｌｉｎｉｃａｌａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｓｉｃｒｅｓｅａｒｃｈ .Ａｎｔｉ ＣＤ3ＳｃＦｖ(ａｎｔｉ ＣＤ3Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｖａｒｉａｂｌｅｒｅ ｇｉｏｎ)ｉｓａｋｉｎｄｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｍｕｒｉｎｅＯＫＴ3ｈｙｂｒｉｄｏｍａ .Ａｓａｐｏｔｅｎｔｍｉ…     

人白介素17受体样分子的克隆及表达

目的　构建带有 6×myc的人白介素 17受体样分子的重组表达质粒 ,以便检测hIL 17RLM L基因在真核细胞中的特异性表达。方法　设计带有酶切位点 (EcoRⅠ和XhoⅠ )的特异性引物 ,用PCR方法扩增hIL 17RLM L片段回收后插入带有 6×myc标签的 pcDNA3.0真核表达载体 ,转染COS7细胞后作Westernblot检测其表达。结果　成功地构建了带有 6×myc标签的 pcDNA3.0 6×myc /hIL 17RLM L重组质粒 ,Westernblot检测到该质粒可在真核细胞中表达。结论　用分子生物学的方法成功地构建了真核表达质粒pcDNA3.0 6×myc /hIL 17RLM L ,使该基因的特异性检测成为可能 ,为进一步研究hIL 17RLM L的生物学功能奠定了基础。     

先天性长QT综合征相关人类HERG基因真核表达载体的构建及其功能表达

目的构建先天性长QT综合征相关HERG基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,建立稳定的细胞系,探讨基因的功能。方法原核克隆载体pGEM-HERG经限制性内切酶获得HERG cDNA,将HERG cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3中,用Lipofectamin2000转染试剂介导将pcDNA3-HERG及荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至HEK-293细胞,利用G-418进行细胞筛选,并用稀释法建立稳定的HEK-HERG细胞系。用全细胞膜片钳技术检测HERG基因的功能表达情况。结果在原核克隆载体pGEM-HERG的基础上构建了HERG的真核表达载体pcDNA3-HERG,并使其在HEK-293细胞中成功表达,建立的HEK-HERG细胞系稳定传代。膜片钳技术检测到了HERG通道电流的表达。结论该方法可成功构建及表达HERG的真核表达载体,为今后突变型HERG的研究奠定了基础。     

Studies on DNA Vaccine of the Conservative Region of Gene Encoding the Male-Specific Gynecophoral Canal Protein of Schistosoma japonicum (Chinese strain)

Schistosome parasites are unique among thetrematodes that the sex are separated. The maleand female Schistosome are different individualswhich have the particular characteristic. The de-velopment and fertility of the female Schistosomeis completely dependent on continuous amphimixiswith male. Unpaired female remain stunted andsexually immature . The female worm required theinteraction with male worm to achieve the sexualmaturity[1]. The mature worm produced a largenumber of eggs in the anima…     

Eukaryotic expression and biological activity analysis of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin

Objective To investigate the expression of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin (HNG) in eukaryotic cells by gene engineering technique and analyze its biological activity. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of HNG with FLAG in its C-terminal was obtained, which was cloned into the plasmid pcDNA3.1(-), and the resultant recombinant vector pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was transfected into PC12 cells. At the same time, the recombinant vector pcDNA3.1(-)/EGFP was transfected to control the efficiency of transfection. The expression of HNG in the cells was determined by immunocytochemistry. In order to analyze the biological activity of the expressed HNG, 25μM Aβ25-35 peptide was added to the culture medium of the transfected cells for 24h, then cell morphology, MTT assay and Hoechst 33258 staining were observed. Results The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was identified by enzyme digestion and sequencing. HNG was highly expressed in PC12 cells. After exposure of PC12 cells to 25μM Aβ25-35 for 24h, cell viability decreased to (65.8±5.3)%, and the dystrophic changes of neuritis and nuclei condensation were obvious. When cells were pre-transfected with pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG, Aβ25-35-induced cell death and morphological changes of cells and nuclei were suppressed. In contrast, pre-transfected with empty vector did not protect cells from Aβ25-35-induced toxicity. Conclusion The eukaryotic expression vector for FLAG-tagged HNG was successfully constructed and expressed in PC12 cells. Expressed HNG has biological activity.     

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的通过生物技术获得促甲状腺激素受体膜外区表达载体,为TSHR膜外区的研究提供有力工具。方法从人甲状腺组织中提取总RNA,RT-PCR分离得到TSHR膜外区cDNA,双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果经酶切鉴定、测序分析表明TSHR膜外区片段与GenBank提供的完全相同。结论成功构建了人TSHR膜外区真核表达载体。     

Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建Apoptin的原核表达载体,并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法在获得Apoptin融合基因的基础上,成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a( )-Apoptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a( )-Apoptin的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与Apoptin融合蛋白一致。结论Apoptin原核表达载体pET-28a( )-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白,为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。