猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的研究,构建携带猪源性CTLA4Ig融合基因的重组腺病毒载体.方法 分离猪外周血单个核细胞,经RT-PCR扩增pCTLA4胞外段基因.将PCR产物克隆入pGH IgG,阳性克隆以双酶切及测序鉴定.将目的融合基因pCTLA4Ig克隆人腺病毒穿梭载体pSh...     

表达US3基因腺病毒载体下调CTL和NK细胞对其转染肝细胞杀伤活性的影响

目的研究表达US3基因重组腺病毒载体对其转染肝细胞介导的免疫逃逸活性。方法首先构建表达US3基因腺病毒载体,扩增纯化后转染HL-7702肝细胞,利用细胞毒性T细胞(CTL)杀伤实验和自然杀伤细胞(NK)杀伤实验,检测表达US3基因重组腺病毒载体的免疫活性。结果表达US3基因的重组腺病毒r-US3成功构建,r-US3能够明显降低CTL和NK细胞对转染肝细胞的杀伤活性。结论表达US3基因腺病毒载体在一定程度上能够介导转染肝细胞的免疫逃逸,降低机体免疫系统对转染肝细胞的排斥反应。     

CXCR7-shRNA靶向抑制结肠癌SW620细胞的体外实验研究

目的探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法①设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;②将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验的表达载体;③MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;④细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;⑤Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果①测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别3.16×108pfu/mL、4.27×108 pfu/mL、3.93×108pfu/mL和2.95×108pfu/mL;②3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P<0.05);③CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有统计学差异(P<0.05);④SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,差异有统计学意义(P<0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,差异有统计学意义(P<0.05);⑤CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论 CXCR7被沉默后可有效抑制SW620肿瘤细胞的增殖与迁移,这为后续研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的肿瘤基因治疗打下良好基础。     

表达HCV core-Ant的重组慢病毒的构建

目的 构建表达HCV 核心区的重组慢病毒,以探讨HCV感染后该病毒核心蛋白对肝脏干细胞转分化的影响.方法 利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得HCV core-Ant基因克隆,酶切后连入pLenti6/V5-D-TOPO质粒,得到pLenti6/V5-D-HCV core-Ant,连同pLP/VSVG、pLP1和pLP2四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCV core-Ant重组慢病毒.收集病毒上清,大量扩增,用免疫组化法检测目的 基因在Hela细胞的表达.用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒并测定其滴度.结果 克隆出HCV core-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;使用表达HCV core-Ant重组慢病毒感染Hela细胞,免疫组化实验证实胞浆有HCV core表达.使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光,说明构建慢病毒载体有效.结论 通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCV core的重组慢病毒,为进一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础.     

重组小鼠血管抑素基因在胆囊癌细胞中的表达及对血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的　研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞能否表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白。方法　应用脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC SD ,G4 18抗性筛选 ;以Westernblot检测血管抑素的表达 ,以血管内皮细胞增殖分析检测其活性。结果　经Westernblot检测 ,得到高表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆 ,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖 (P <0 .0 5 )。结论　小鼠血管抑素基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转导的胆囊癌细胞能够表达具有生物学活性的血管抑素蛋白 ,在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值     

慢病毒转染荧光蛋白EYFP-H148Q/I152L细胞模型的构建

目的构建稳定表达EYFP荧光蛋白的HeLa细胞作为阴离子(卤素)通道阻断剂筛选的细胞模型,为高通量筛选阴离子(卤素)通道阻断剂提供条件。方法通过基因重组技术构建表达YFP突变蛋白(EYFP-H148Q/I152L)和puromycin抗性的慢病毒载体。将慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞产生慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,进一步利用抗性基因对细胞进行puromycin筛选,纯化细胞并扩增至所需细胞量。采用实时定量PCR和Western blot方法检测目的基因EYFP-H148Q/I152L的表达效率。并验证EYFP-HeLa稳转细胞系作为卤族离子通道阻断剂筛选模型的活性。结果基因测序验证了目的基因成功插入慢病毒载体。RT-PCR和Western blot检测结果显示,目的基因在HeLa细胞中实现了过表达。荧光显微镜下观察到EYFP-HeLa稳转细胞株能够表达特有的EYFP黄色荧光,效率接近100%。碘离子(I-)(低渗)溶液刺激细胞阴离子(卤素)通道的开放,内流的I-能够使黄色荧光淬灭。结论构建的EYFP-HeLa细胞系能够稳定表达EYFP黄色荧光蛋白,对内流入细胞的I-敏感,可以作为理想的阴离子(卤素)通道阻断剂的筛选模型。     

靶向RWDD3基因shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建RWD结构小泛素化增强子(RWDD3)shRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤细胞RWDD3基因的相关研究奠定基础。方法设计RWDD3的3条siRNA的靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA发卡结构shRNA,分别与双酶切后的载体连接,构建3种重组质粒pGC-LV-shRNA1、pGC-LV-shRNA2和pGC-LV-shRNA3,并转化于DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒测序,转染293T细胞,生产慢病毒颗粒,并检测病毒滴度。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别感染人脑胶质瘤细胞U251,实时定量PCR和Western blot分别检测RWDD3mRNA和蛋白的沉默效果。结果测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功,滴度分别为5×10~(11) TU/L、4×10~(11) TU/L、5×10~(11) TU/L。感染U251后,RWDD3mRNA及蛋白的表达量均较阴性对照组和未感染组明显降低(P<0.05);其中以LV-RWDD3-shRNA-1作用显著,mRNA表达下调79.2%,蛋白表达下调68.2%(P<0.05);而阴性感染对照组和未感染组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建3种RWDD3shRNA慢病毒表达,可有效下调U251细胞RWDD3mRNA和蛋白的表达,其为进一步研究以RWDD3为靶点的脑胶质瘤基因治疗提供稳定转染细胞的载体奠定基础。     

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

SLC-Her-2/neu-p53-Fc融合基因重组腺病毒真核表达载体对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果

目的扩增纯化携带融合基因SLC-Her-2/neu-p53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体,研究其对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果。方法将重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc在人胚肾293细胞中扩增、纯化;向小鼠皮下注射表达Her-2/neu-p53融合基因的B16F10-psig-Her-2/neu-p53细胞(B16-HP细胞)建立荷黑色素瘤小鼠模型;将小鼠随机分成对照组、肌肉注射组和皮下注射组,用重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体进行治疗,观察肿瘤生长情况,测定细胞毒性活性、血清p53抗体。结果纯化后重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体滴度8×108pfu/mL。目的基因SLC-HP在小鼠体内成功表达。重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能有效抑制小鼠肿瘤的生长,瘤重与对照组比较差异有统计学意义(P=0.005),抑瘤率达到98.8%,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤力有明显提高。结论重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能延长出瘤时间,抑制肿瘤的生长。     

反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达

目的构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的反转录病毒载体,并且探讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法使用基因重组技术构建携带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3细胞,计数NIH3T3荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度;使用RV载体感染SK-N-SH细胞,通过流式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。结果成功构建了基因转移载体RV/EGFP,确定重组病毒的浓度为8.3×106病毒颗粒/mL。在SK-N-SH细胞RV/EGFP稳定转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到30%以上。结论SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染,在转基因细胞株外源基因的表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。     

TAT-BACEsp-GFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础.方法 利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TAT-BACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TAT-BACEsp产物与设计的完全吻合;TAT-BACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点.结论 成功构建了TAT-BACEsp与GFP 融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体.     

携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建

目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒,为探讨AcSDKP(乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸)的多样化功能提供基础。方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板,PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段,插入腺相关病毒载体穿梭质粒pSSHG-CMV,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞,包装rAAV-NT4-AcSDKP,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。结果成功合成NT4-AcSDKP基因,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP,包装获得滴度为3.40×1010 copies/mL的重组腺相关病毒。结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒,为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

大骨节病差异表达基因PAPSS2对成骨细胞矿化及碱性磷酸酶活性的影响

目的探讨大骨节病差异表达基因PAPSS2在MC3T3-E1细胞成骨样分化过程中的表达及其对碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞矿化的影响。方法培养MC3T3-E1细胞并诱导成骨分化,观察PAPSS2在成骨细胞分化过程中的基因及蛋白表达情况;用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术或逆转录病毒转染高表达载体,分别构建PAPSS2低表达慢病毒及逆转录病毒高表达载体包装,滴度测定,验证细胞转染效率;分别转染MC3T3-E1细胞并设空白对照组,观察PAPSS2沉默或高表达后ALP活性的变化及细胞成骨矿化的影响。结果 PAPSS2在成骨细胞分化过程中mRNA及蛋白均随着矿化过程表达增加。用慢病毒介导的RNAi技术,成功降低了MC3T3-E1成骨细胞中PAPSS2的表达,使用逆转录病毒转染高表达载体显著增加PAPSS2基因的表达。PAPSS2沉默表达时,ALP活性和细胞矿化作用显著降低,高表达后其作用相反。结论 PAPSS2可调节成骨细胞ALP活性和细胞矿化作用,其异常表达可能与大骨节病骨骼病变相关。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

NT4p53(C22)Ant融合基因重组腺病毒的构建及对肝癌细胞的杀伤作用

目的构建编码融合基因NT4p53(C22)Ant嵌合肽的重组腺病毒表达载体,并研究其对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用。方法使用分子克隆技术,通过同源重组获得重组腺病毒rAVV-NT4p53(C22)Ant,收集上清、大量扩增并测定其滴度。感染人肝癌HepG2细胞,采用免疫组化法检测p53表达,MTT实验、流式细胞仪观察rAAVNT4p53(C22)Ant对肿瘤细胞的杀伤作用。结果成功构建重组腺病毒表达载体,感染人肝癌HepG2细胞后p53表达率为(44.88±2.45)%;MTT检测显示,细胞存活率随作用时间延长明显降低,与空病毒组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),流式细胞仪检测显示G0/G1期细胞比例及凋亡细胞较空病毒组及对照组增加。结论构建的NT4p53(C22)Ant重组腺病毒在肝癌细胞中能有效表达,对肝癌HepG2细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。