miR-497靶向调控疾病易感基因EFNB2的分子机制研究

目的用分子克隆和双荧光素酶报告基因的方法研究miR-497对精神分裂症易感基因EFNB2的靶向调控作用,为miR-497在精神分裂症中的分子功能研究奠定基础。方法运用生物信息学在线软件预测,发现与精神分裂症相关的miR-497可能直接调控疾病易感基因EFNB2。随后采用分子生物学技术扩增EFNB2基因3′-UTR中包含与miR-497种子序列相结合的片段,将该片段连接入pmirGLO质粒载体构建野生型的重组体(WT),并突变EFNB2基因3′-UTR与种子序列相结合的碱基序列,构建突变型的重组体(MUT)。最后将miR-497阴性对照(NC)和模拟物(mimics)分组转染HEK293T细胞系,并在24、48h后分别进行双荧光素酶报告基因活性测定。结果测序结果表明EFNB2基因3′-UTR的野生型(WT)和突变型(MUT)分别成功构建入pmirGLO载体中,表明WT和MUT的重组体均构建成功。转染24、48h后的双荧光素酶报告基因活性检测结果表明,miR-497mimics与NC相比,显著性降低了报告基因的活性。结论本研究在细胞水平证明了miR-497可直接调控精神分裂症易感基因EFNB2,为后续miR-497在精神分裂症中的功能研究提供了新思路和新线索。     

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究

目的　构建编码结核分枝杆菌蛋白Ag85A基因为基础的DNA疫苗。 方法　采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因组中 ,扩增出分泌蛋白Ag85A成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后 ,插入克隆载体 pGEM TEasy中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3.1的相应酶切位点。重组质粒肌注免疫小鼠 ,4周后用ELISA法检测抗体滴度。结果　结核分枝杆菌H37Rv株Ag85A成熟蛋白的编码基因经序列测定证实无突变 ;经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定证实克隆基因正确插入载体 pcDNA3.1。ELISA法检测几何平均滴度为 1∶10 0 0。结论　以Ag85A成熟蛋白的编码基因为基础的DNA疫苗的成功构建和表达 ,为进一步研究其在结核病与肿瘤防治方面的作用奠定了基础     

外排系统与膜通透性的改变对淋球菌高水平多重耐药的影响

目的 探讨外排系统与膜通透性的改变对淋球菌多重耐药的影响.方法 PCR扩增淋球菌mtrR启动子区域包含13 bp回文序列在内的157个碱基片段并进行DNA测序分析;提取外膜蛋白,利用SDS-PAGE进行组成型的分析.结果 5株敏感株的mtrR启动子区域未发生突变,3株高水平多重耐药株的mtrR启动子区域13 bp回文序列均发生了单个A/T碱基的缺失,且均存在外膜孔蛋白表达的缺失.结论 mtrR启动子区域13 bp回文序列单个A/T碱基的缺失引起的mtrCDE外排泵表达增加与外膜孔蛋白表达的缺失或下降导致的膜通透性降低,在介导淋球菌产生高水平多重耐药中起一定的作用.     

结核多表位DNA疫苗免疫效果及其对小鼠耐药结核病的疗效观察

目的研究比较结核分枝杆菌Hsp70、Ag85A、ESAT-6多表位DNA疫苗和卡介苗(BCG)的免疫效果,观察该疫苗联合抗结核药物治疗耐药结核病小鼠的疗效。方法随机将BALB/c小鼠分成A、B、C组,分别用PBS、BCG和多表位DNA疫苗经皮下免疫,1、3、5周各免疫1次。免疫后眼球采血,分离血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法测定特异性IgG抗体,用ELISA双抗体夹心法测定IL2和IFN-γ;同时分离小鼠脾细胞,用MTT法测定淋巴细胞增殖指数。为观察多表位疫苗的疗效,小鼠尾静脉注射结核分枝杆菌双耐菌株(耐利福平和耐异烟肼),4周后将感染模型小鼠随机分成D、E、F 3组,其中D组为阴性对照,注射生理盐水;E组用利福平、异烟肼治疗;F组为联合用药组,用结核分枝杆菌Hsp70、Ag85A、ESAT-6多表位DNA疫苗和利福平、异烟肼联合治疗,疗程均为10周。治疗结束后称取小鼠体重,取其肺、肝、脾,称取质量,并作肺和脾脏菌落计数。结果多表位DNA疫苗组小鼠血清特异性IgG抗体、IL2、IFN-γ和淋巴细胞增殖指数均明显高于PBS组和BCG组(P<0.05);多表位DNA疫苗联合抗结核化疗药能明显降低耐药结核病小鼠肺、脾菌落计数和肺、肝和脾脏指数(P<0.05)。结论结核分枝杆菌Hsp70、Ag85A、ESAT-6多表位DNA疫苗能在小鼠体内诱导较强的特异性免疫反应,产生高水平的特异性IgG抗体、诱导IL2和IFN-γ分泌和特异性淋巴细胞增殖,并能显著提高抗结核药物对耐药结核病小鼠的疗效。     

葡萄球菌的耐药性分析

目的研究医院内葡萄球菌属细菌的耐药状况,为临床合理、有效地使用抗生素提供依据。方法用K-B法对采集的咽拭子标本中分离到的葡萄球菌进行药敏试验,采用双重PCR方法检测葡萄球菌的FemA及MecA基因。FemA和MecA基因均为阳性者为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)菌株,仅MecA基因阳性者为耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci,MRCNS)。结果从采集的361份标本中,分离出葡萄球菌220株,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)110株。住院患者、医护人员葡萄球菌标本中凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negative Staphylococci,CNS)分别占84/151(55.63%)、13/25(52.00%),均高于正常人群的13/44(29.55%)(P<0.05);住院患者中的耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus,MRS)对除万古霉素外的常用抗生素均有明显的耐药性。住院患者分离的67株SA中检测到MRSA菌株31株(46.27%);84株CNS中检测到MRCNS菌株26株(30.95%)。结论住院患者标本中的葡萄球菌对常用抗生素均有明显的耐药性,且CNS的比例显著高于正常人群;其中MRS几乎对所有抗生素都表现为耐药,表明MRS已成为医院内感染的重要致病菌。用双重PCR方法检测MRSA,比药敏试验简单,且快速、准确、敏感、特异性强,具有很好的临床应用价值。     

PCR-SSP检测人胰腺癌细胞株PC-2K-ras基因点突变及其方式

目的　检测人胰腺癌细胞株PC 2K ras基因点突变及其突变方式 ,明确基因治疗靶点的碱基序列。方法　针对K ras基因第 1 2位密码子点突变方式 (CGT、CAT、GTT)设计顺序特异性引物 (SSP) ,对人胰腺癌细胞株PC 2进行聚合酶链反应 (PCR) ,扩增产物借助聚丙烯酰胺凝胶电泳判定该细胞株有无K ras基因点突变及其突变方式。结果　人胰腺癌细胞株PC 2存在K ras基因点突变 ,突变方式为CGT。结论　PCR SSP法简便快速 ,特异性高 ,本研究结果为胰腺癌的下一步基因治疗奠定了基础     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI载体的构建、融合表达及纯化

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表达载体,并在E.coliBL21中表达,为进一步研究UreI的功能奠定基础。方法利用分子克隆技术以Hp DNA染色体为模板,扩增Hp UreI基因片段,将目的基因UreI与载体pET32a( )分别经kpnⅠ和HindⅢ双酶切,纯化,连接。筛选阳性重组载体,转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达pET32a( )/UreI融合蛋白。表达产物经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,用SDS-PAGE及Western blot分析。结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp UreI编码基因,由585 bp组成,与GenBank相应菌株HP AM417 609序列完全一致,无碱基突变。经SDS-PAGE分析显示重组质粒pET32a( )/UreI在原核细胞中得到了高效融合表达,其重组融合蛋白分子量为130 ku,经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上,Western blot分析显示,该重组融合蛋白可被6-His鼠抗单克隆抗体所识别,具有良好的反应原性。结论成功地克隆和构建了原核表达载体pET32a( )/UreI,并在原核细胞中得到了高效融合表达。     

K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌靶基因表达的抑制作用

目的　观察针对于胰腺癌K ras基因点突变的反义寡核苷酸对靶基因表达的抑制作用。方法　脂质体将人工合成的针对于K ras基因第 12位密码子点突变的反义寡核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC 2 ,用免疫组化和原位杂交技术检测靶基因的表达。结果　转染 4 8h后 ,反义寡核苷酸作用组胰腺癌细胞株PC 2的ras蛋白和K rasmRNA的表达程度较正义组和对照组均明显降低 (P <0 .0 5 )。结论　针对于K ras基因点突变的反义寡核苷酸作用于体外培养的胰腺癌细胞 ,对靶基因的表达有明显的抑制作用     

秦巴山区孕妇人巨细胞病毒宫内感染与UL54、UL97基因突变的关系

目的探讨秦巴山区孕妇妊娠期人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染与HCMV UL54、UL97基因突变的关系。方法采用PCR方法检测228对孕妇血清和新生儿脐血血清中的HCMV DNA,对HCMV DNA阳性者采用限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子是否发生突变。结果①228例孕妇血清中HCMV DNA阳性者19例,阳性率为8.33%;新生儿脐血血清中HCMV DNA阳性8例,阳性率为3.51%。在19例HCMV DNA阳性孕妇中,其配对脐血阳性7例,HCMV宫内传播率为36.84%。②HCMVDNA阳性孕妇血清及其配对脐血阳性的标本中均未发现HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子发生突变。结论秦巴山区HCMV宫内感染的发生率较高,其发生与HCMV UL54、UL97基因501、594及595密码子突变无相关性,但不排除存在其他位点突变或其他形式基因异常导致病毒致病性改变的可能性。     

SD大鼠Atoh1基因CDS区的克隆及序列分析

目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1 cDNA编码序列并测定分析其克隆序列。方法采用非对称互补引物/模板法,制备Atoh1 cDNA的编码序列,将其克隆入PMD-19T载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析表明,扩增得到的大鼠Atoh1基因CDS区全长为1 056 bp,编码351个氨基酸;测定序列与GenBank中公布的参考序列对比,有2处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致。这两处碱基应为单核苷酸多态性(SNP)位点,突变为无义突变,不影响蛋白的表达。结论成功克隆了Atoh1 cDNA编码序列,为进一步对感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。     

慢性乙肝患者HBV核心蛋白启动子变异的初步研究

目的　通过对乙型肝炎病毒 (HBV)基本核心基因启动子 (BCP)变异的研究 ,阐明HBV准种在慢性感染者中存在的意义。方法　以中国株HBV基因序列为依据 ,设计特异性多聚酶链反应 (PCR)引物 ,自 4 0例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV的BCP基因 ,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)技术展示缺失突变 ,DNA测序确定病毒的变异程度。结果　聚丙烯酰胺凝胶电泳结果发现 ,6 0 % (2 4 / 4 0 )患者血清中可见 2～ 3条扩增条带 ;测序结果发现BCP区存在多种突变形式 :点突变中以 14 0nt(T→C)最为常见 ,缺失突变多见于TA1,TA2及TA3,多表现为 8bp和 2 0bp的缺失。 结论　HBVBCP区内有一缺失高变区 ,并在患者体内存有多种变异形式 ;TA1,TA2和TA3的变异可能影响e抗原的表达。HBV慢性携带者体内有HBV准种共存     

胃癌组织来源的突变型DNA聚合酶β的碱基切除修复功能

目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a(+)表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌,经诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。设计3条单链DNA引物,退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化蛋白共做碱基切除修复(BER)实验,最后琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果成功构建了pET28a(+-)polβ重组表达载体;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其切开,突变型DNA聚合酶β不能或部分将其切开。结论野生型DNA聚合酶β能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型DNA聚合酶β在碱基缺失修复过程中的作用丧失或减弱。     

临床分离携带psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌的SCCmec型别分析

目的探讨临床分离携带psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的SCCmec型别。方法收集临床分离并经全自动微生物鉴定系统准确鉴定的表皮葡萄球菌165株,通过PCR扩增esp和mecA基因准确鉴定MRSE,扩增psm-mec、fudoh和p221片段鉴定携带psm-mec菌株。采用多重PCR对携带psm-mec基因的MRSE的mec、ccr和SCCmec进行分型。结果 138株MRSE菌株中,29株携带psm-mec基因,携带率为17.58%。多重PCR对mec和ccr分型结果显示,携带psm-mec基因MRSE均为Class A mec,但ccr型别存在明显的多样性。多重PCR对SCCmec分型结果显示,所有菌株均可扩增出Ⅱ型和/或Ⅲ型SCCmec条带,且为混合型别。结论临床分离携带psm-mec基因的MRSE的SCCmec具有同源性,以含Class A mec的携带Ⅱ型和/或Ⅲ型SCCmec为主。     

DNA序列分析确认1例新的HLA-B等位基因B4814

目的识别确认中国人群中1例新的HLA等位基因。方法使用PCR-SSP和测序为基础的分型技术,分析确认HLA-B*的新等位基因。结果先证者HLA-B位点有一个等位基因的核苷酸序列与已知的HLA等位基因均不同,该基因和B*4812的差异在第3外显子区域的419位碱基A>C,486位碱基C>G,512位碱基G>T。导致116编码子TAC>TCC,编码的氨基酸由酪氨酸(Tyr)变成丝氨酸(Ser),147编码子TGG>TTG,编码的氨基酸由色氨酸(Trp)变成亮氨酸(Leu)。结论该基因为HLA新的等位基因,2005年10月被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4814。     

肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶的基因分型

目的研究西安交通大学医学院第一附属医院临床分离的肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型分布特点。方法收集从临床住院患者中分离的肺炎克雷伯菌83株,ESBLs表型确认试验采用双纸片协同法,ESBLs耐药基因CTX-M、TEM和SHV的检测采用PCR法。结果 83株肺炎克雷伯菌中表型确证实验有76株ESBLs阳性,占91.6%;PCR法检测到携带有耐药基因的菌株41株,CTX-M、SHV和TEM 3种耐药基因的构成比分别为78.1%(32/41)、43.9%(18/41)和34.2%(14/41);在41株产酶菌株中,携带1种基因型的占39.0%(16/41),携带2种基因型的占34.2%(14/41),携带3种基因型的占14.6%(6/41),携带4种基因型的占9.8%(4/41),携带5种基因型的占2.4%(1/41)。结论该院肺炎克雷伯菌ESBLs的基因型主要以CTX-M型和SHV型为主,其基因型分布复杂。     

头孢西丁耐药的葡萄球菌mecA基因检测及耐药性分析

目的对头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的可靠性进行评价,并分析头孢西丁耐药的葡萄球菌即MRS感染及耐药性情况,以指导临床合理用药。方法临床分离葡萄球菌310株,以PCR检测葡萄球菌mecA基因为判断MRS的标准,按美国国家临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)标准操作规程进行头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法(K-B法)药敏试验检测MRS,同时检测MRS及甲氧西林敏感葡萄球菌(MSS)对10种常用抗生素的耐药性。结果在310株葡萄球菌中金黄色葡萄球菌198株,凝固酶阴性葡萄球菌112株,经mecA基因检测,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为57.1%(113/198),耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)为62.5%(70/112);头孢西丁纸片扩散法检测MRSA的敏感性和特异性均为100%,检测MRCNS敏感性为98.6%,特异性为100%;除复方新诺明和万古霉素外,MRS对其余8种抗生素的耐药率明显高于MSS,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论头孢西丁纸片扩散法操作简便,结果可靠,可作为临床实验室检测MRS的常规方法;MRS的感染发生率及耐药性较高,且对各类抗生素多重耐药,需加强其耐药性监测。     

结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测

目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体,成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定后用含Ni 2+的His-bind树脂柱亲和层析纯化phoS2,并用Western blot对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明,成功构建了基因工程菌株高效表达质粒phoS2/pET32a。IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果显示,上清液中只见极少量的特异蛋白表达带,沉淀部分可见明显的特异表达带,说明phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的phoS2分子质量为37 953ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37 953.1ku,理论等电点为5.75,具有1个跨膜区,位于1¹9位,结构域位于119位,结构域位于1³70位。结论成功构建了结核分支杆菌phoS2/pET32a重组质粒,phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。     

淋球菌不同耐药水平中mtrF基因的表达

目的探讨mtrF基因在多重耐药淋球菌中的表达及其与高水平多重耐药淋球菌的关系。方法①纸片扩散法检测58株淋球菌对5种抗生素的敏感性;②试管稀释法测定淋球菌对红霉素的最小抑菌浓度(MIC);③采用RT-PCR技术测定敏感组、低-中等水平多重耐药组及高水平多重耐药组中mtrD、mtrF基因的表达。结果①58株淋球菌中对2种或者2种以上抗生素耐药的有30株,占待测淋球菌的51.7%;②红霉素MIC为敏感、中介、耐药,分别为7株、21株和30株,有17株MIC值≥32.0μg/mL;③高水平多重耐药组mtrF基因表达量升高,与低-中等水平耐药组和敏感组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);但后两者之间无明显差异。耐药组mtrD基因表达量升高,与敏感组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);但两个耐药组之间无明显差异。结论mtrF基因在高水平多重耐药组中表达均高于敏感组和低-中等水平多重耐药组,表明其在介导淋球菌产生高水平多重耐药过程中可能发挥着十分重要的作用。     

rep-PCR法在检测产超广谱β内酰胺酶大肠艾希氏菌院内流行中的应用

目的分析重复序列引物聚合酶链反应(rep-PCR)的优化条件,并采用本方法分析本院呼吸科病房不同患者痰标本中分离到的产超广谱β内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌是否起源于同一菌株。方法用双纸片确定法测定是否产ESBL;用K-B法测定对抗生素的敏感程度;选用肠道菌广泛存在的基因间重复片断为引物进行扩增,并对实验条件进行优化;对产ESBL大肠艾希氏菌进行基因分型分析。结果建立了rep-PCR法方法,显示可将大肠艾希氏菌扩增出丰富的区带。分离到的22株产ESBL大肠艾希氏菌分属3个基因型。结论rep-PCR法可用于医院院内感染的流行病学调查。