人CAP1蛋白真核表达及细胞定位与功能

目的构建CAP1蛋白真核表达质粒并使之在细胞内得以表达,确定CAP1蛋白在细胞中的定位及其对细胞迁移的影响。方法以HeLa细胞cDNA为模板,经PCR获取CAP1编码区cDNA,将该编码区cDNA序列插入pCMV-Myc质粒中,构建带Myc标签的真核表达重组质粒。重组质粒转染至293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达;重组质粒转染HeLa细胞,免疫荧光法检测其细胞内的定位,划痕实验观察其对细胞迁移的影响。结果成功构建了CAP1真核表达重组质粒,并在真核细胞内成功表达,确定CAP1定位于细胞质中,划痕实验证明CAP1过表达的细胞迁移能力明显下降。结论在真核细胞中成功表达了CAP1重组质粒且CAP1定位于细胞质,其过表达对细胞迁移有抑制作用,为研究CAP1的生理功能奠定实验基础。     

SIK2 cDNA及其截短体原核表达重组体的构建及表达

目的构建SIK2cDNA及其截短体的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达。方法分别设计SIK2及其截短体引物,采用PCR方法分别扩增SIK2、SIK2-Δ1(280⁹26)、SIK2-Δ2(400926)、SIK2-Δ2(400⁹26)、SIK2-Δ3(1926)、SIK2-Δ3(1⁴00)、SIK2-Δ4(700400)、SIK2-Δ4(700⁹26)五个cDNA片段,并将扩增的cDNA片段插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST标签的重组质粒。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导SIK2、SIK2-Δ1、SIK2-Δ2、SIK2-Δ3和SIK2-Δ4五个截短体的原核表达,用考马斯亮蓝染色和Western blot进行鉴定。结果成功构建了SIK2全长及其截短体cDNA的重组质粒,用考马斯亮蓝染色及Western blot鉴定显示,SIK2全长及其截短体重组质粒均在大肠杆菌中诱导表达。结论在大肠杆菌中成功地诱导表达了SIK2重组蛋白及其截短体,为进一步研究SIK2各结构域的功能提供了实验基础。     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　将具有全长血小板生成素 (TPO)活性的N端截短血小板生成素cDNA(T1 84)作为目的基因 ,在中华仓鼠卵巢细胞 (CHO)中成功表达。方法　将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶 (DHFR)为筛选扩增基因的 pDC B真核表达载体 ,通过不断提高MTX浓度 ,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果　构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒 ,并能在CHO细胞中高效表达。结论　N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达 ,其产物具有全长TPO的活性。     

不含氨基末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步功能研究

目的 从分子水平阐述人类PIF1解螺旋酶的生理功能,纯化只含有解螺旋酶模序,不含N-末端的PIF1蛋白--PIF1△N,并对其生物化学活性进行检测.方法 以Hela细胞的cDNA文库为模版,PCR扩增得到PIF1的540～1 923的cDNA序列,在cDNA的5′端引入六聚组氨酸标签后插入pET20b表达载体,得到重组质粒pET20-PIF1△N.通过共转化此重组质粒和一个编码稀有rRNA的质粒,PIF1△N蛋白在大肠杆菌中得到表达.在4 ℃通过一系列亲和层析柱,用高效液相纯化系统纯化了PIF1△N蛋白,并检测其生物化学活性.结果 从Hela 细胞的cDNA文库中克隆了PIF1蛋白的540～1 923的基因片段,使其在大肠杆菌中成功表达.建立了纯化PIF1△N蛋白的亲和层析方法, 并检测了其ATP酶活性.结论 不含N-末端的PIF1蛋白-PIF1△N,具有依赖镁离子和DNA的ATP酶活性.     

人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

目的 克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因,构建重组真核表达质粒,获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白.方法 应用RT-PCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RT-PCR鉴定基因转录,用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白.结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因,表达蛋白具有免疫活性.结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达.     

人B7.2 cDNA的克隆及其真核表达

为克隆人 B7.2 c DNA,构建 B7.2真核表达质粒 ,并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞 ,经 LPS诱导后 ,以 RT- PCR,克隆 B7.2 c DNA;构建真核表达质粒 p BCMGSNeo- B7.2 ,转染哺乳细胞 ,进行表达。结果成功克隆了 B7.2c DNA,并经测序证实 :所构建的 B7.2抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经 LPS诱导的人淋巴细胞可表达 B7.2 m RNA,所建立的 p BCMGSNeo-B7.2哺乳动物真核表达质粒 ,可供进一步研究 B7.2结构和功能。     

硒蛋白S截短和全长重组质粒的构建与表达

目的构建截短和全长硒蛋白S(SelS)重组体,以期在细胞系中或动物体内高表达并观察其生物学效应。方法用基因重组技术构建SelS的截短体和全长的重组质粒,截短体基因只包含mRNA的编码序列(CDS),全长包括mRNA的CDS和3′非翻译区(UTR)序列,此序列中含硒代半胱氨酸的插入序列(SECIS)。将重组质粒送公司测序并比对。用脂质体2000将硒蛋白SelS质粒转染至细胞中,24h后观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞技术检测细胞的转染效率;收集细胞用Trizol法提取总RNA,将mRNA反转录为cDNA,以此为模板用PCR扩增以观察目的基因的表达。结果测序结果显示重组序列与目的基因完全一致,质粒构建成功。显微镜下可观察到细胞高表达绿色荧光蛋白,经流式细胞技术验证细胞的转染效率达到40%以上。PCR产物的凝胶电泳结果显示:与对照组及其他实验组相比,只有转染了目的基因的实验组高表达截短和全长的SelS基因。结论成功构建SelS截短的和全长的重组质粒并转染入细胞中高表达,对观察硒蛋白截短体和完整形式在细胞系或动物体内的生物学效应提供了基础。     

HSV-1截短gB基因DNA疫苗的构建及初步鉴定

目的　为有效预防单纯疱疹Ⅰ型病毒 (HSV - 1 )感染 ,给多价DNA疫苗的构建奠定基础 ,构建表达截短HSV - 1 gB糖蛋白的DNA疫苗。方法　用PCR技术从HSV - 1基因组中扩增出编码HSV 1gB糖蛋白 1 - 5 1 7氨基酸序列的一段基因序列 ,通过 pGEM -T中介载体 ,将其插入到真核表达质粒pcDNA 3 1 (+)的CMV启动子下游。结果　构建的重组真核表达质粒可在动物体内正确表达目的基因 ,对HSV - 1病毒攻击具有免疫保护作用。结论　本研究对截短HSV - 1 gB基因DNA疫苗进行了初步的探索性研究 ,也为多价HSV 1DNA疫苗的构建奠定了基础。     

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

人白介素17受体样分子的克隆及表达

目的　构建带有 6×myc的人白介素 17受体样分子的重组表达质粒 ,以便检测hIL 17RLM L基因在真核细胞中的特异性表达。方法　设计带有酶切位点 (EcoRⅠ和XhoⅠ )的特异性引物 ,用PCR方法扩增hIL 17RLM L片段回收后插入带有 6×myc标签的 pcDNA3.0真核表达载体 ,转染COS7细胞后作Westernblot检测其表达。结果　成功地构建了带有 6×myc标签的 pcDNA3.0 6×myc /hIL 17RLM L重组质粒 ,Westernblot检测到该质粒可在真核细胞中表达。结论　用分子生物学的方法成功地构建了真核表达质粒pcDNA3.0 6×myc /hIL 17RLM L ,使该基因的特异性检测成为可能 ,为进一步研究hIL 17RLM L的生物学功能奠定了基础。     

反义HSP70真核表达载体的构建和在人喉癌细胞的表达

目的　进行促凋亡治疗喉癌实验 ,构建和鉴定携带反义HSP70 (heatshockprotein 70 )基因的真核表达载体。方法　将HSP70cDNA反向克隆入 pcDNA 3.1,构建CMV启动子控制的真核表达载体 pcDNA AHSP70 ,用酶切鉴定结果 ;应用该载体转染人喉表皮样癌细胞Hep 2 ,G4 18筛选阳性克隆 ;westernblot和免疫组化检测转染前后瘤细胞的HSP70的表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状。结果　获得 pcDNA AHSP70真核表达载体 ,HSP70反义RNA阻断了Hep 2细胞的HSP70的表达 ,经westernblotting和免疫组化证实 ,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70 ,而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的真核表达载体的Hep 2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢 ,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰 ,而空载体组没有。结论　本研究成功构建了反义HSP70真核表达载体并在人喉癌细胞得以表达。     

先天性长QT综合征相关人类HERG基因真核表达载体的构建及其功能表达

目的构建先天性长QT综合征相关HERG基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,建立稳定的细胞系,探讨基因的功能。方法原核克隆载体pGEM-HERG经限制性内切酶获得HERG cDNA,将HERG cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3中,用Lipofectamin2000转染试剂介导将pcDNA3-HERG及荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至HEK-293细胞,利用G-418进行细胞筛选,并用稀释法建立稳定的HEK-HERG细胞系。用全细胞膜片钳技术检测HERG基因的功能表达情况。结果在原核克隆载体pGEM-HERG的基础上构建了HERG的真核表达载体pcDNA3-HERG,并使其在HEK-293细胞中成功表达,建立的HEK-HERG细胞系稳定传代。膜片钳技术检测到了HERG通道电流的表达。结论该方法可成功构建及表达HERG的真核表达载体,为今后突变型HERG的研究奠定了基础。     

The cloning and expression of renalase and the preparation of its monoclonal antibody

To obtain the recombination protein of renalase and prepare the monoclonal antibody, the human renalase gene was amplified from human kidney by specific primer and cloned the DNA fragments into the pET22b. After verification of the positive clones, the gene was transformed to E. coli BL21 to express the protein with 6His on C terminal. The Balb/c mouse was immunized with the purified protein to prepare the monoclonal antibody by hybidoma technique. The renalase protein was reconstructed and 2 strains of the hybidoma which can stable secrete renalase were obtained. The monoclonal antibody can both react with the both recombinant and human serum renalase. Foundation item: the Scientific Research Project of Shanghai Municipal Health Bureau (2008Y034), and the Natural Scientific Research Project of Shanghai (05ZR14086)     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

重组人突变型471TNF-α及野生型TNF-α的表达及活性初步鉴定

目的　采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法　采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,转入大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达野生型及突变型 471TNF α蛋白。初步纯化蛋白后 ,采用MTT法评估两者对L92 9细胞的杀伤作用。结果　①获得了测序正确的野生型TNF α及突变型 471TNF α的cDNA克隆 ;②构建了正常人野生型TNF α及突变型 471TNF α重组表达质粒 ;③经温度诱导 ,TNF α及突变型 471TNF α蛋白均获得了表达 ;④初步的生物学活性研究表明 ,突变型 471TNF α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论　突变型 471TNF α的生物学活性优于野生型TNF α ,为进一步开展TNF α的基础及临床研究奠定了基础     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7蛋白在NIH/3T3细胞中的表达和定位

目的　将带有人乳头瘤病毒 1 6型 (湖北株 )E7基因的真核表达载体 pL(E7 HB)SN导入NIH/3T3细胞进行瞬时表达。方法　重组质粒转染 3T3细胞通过DNA 磷酸钙共沉淀法 ;E7基因表达的检测采用RT PCR和间接免疫荧光实验。结果　E7基因导入真核细胞后能有效转录并表达E7蛋白 ,通过免疫荧光染色可看到E7蛋白主要定位在胞浆中 ,细胞核中也有 ,但量较少。结论　这可能和湖北株HPV1 6E7基因发生突变有关。     

饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达

目的　通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法　应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段 ,并克隆到pUC1 9载体中 ,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列 ,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX 4T 1表达载体中 ,经BamHI和EcoRI双酶切后 1 2 %凝胶电泳鉴定 ,IPTG诱导表达产物经SDS PAGE分析。结果　克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF1 3830 0记载的序列完全一致 ,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65 6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论　本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST Decorin融合蛋白     

论“意象”的“表现”思维向度

蒋寅先生认为,以往学界所讨论的"意象"实际上应该叫"物象",而"意境"是一个完整自足的呼唤性的文本,古人使用的"意境"只是立意取境之义,是个不含价值色彩的中性概念.本文认为:"意象"是最小的表意单位、"境"、"意境"是更大的表意单位,蒋先生忽略了中国"象"思维是"表现"性的而不是"再现"性的这一重要内容.本文拟从"意象"的"表现"思维向度来探索"意象"的特质.     

血小板生成素基因的克隆及在原核细胞的表达

目的　克隆人血小板生成素 (hTPO)基因 ,并使其在原核细胞中获得表达。方法　先从人胚胎肝脏中提取总RNA ,进行RT -PCR获得编码氨基端 1 95个氨基酸残基的hTPO1 95cDNA。将该片段亚克隆至pGEM -Teasy克隆质粒中 ,以双脱氧链末端终止法对克隆质粒直接测序。接着将hTPO1 95cDNA插入到原核表达质粒 pET2 8-a中 ,转化大肠杆菌BLR2 1 (DE3) ,进行诱导表达 ,以SDS -PAGE方法及免疫印迹法进行检测。结果　得到的hTPO1 95cDNA与文献报道的序列完全一致。经诱导后hTPO基因在大肠杆菌中获得表达 ,目的蛋白占总菌体蛋白约 1 0 % ,以免疫印迹法证实表达产物正确。结论　得到hTPO1 95cDNA ,并在原核细胞中获得表达 ,得到截短形式的rhT PO1 95。     

葎草花粉cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建葎草花粉cDNA表达文库,为进一步筛选葎草花粉的主要致敏蛋白组分、制备重组变应原奠定基础。方法采集新鲜葎草花粉,过筛后液氮保存,利用Trizol法抽提葎草花粉总RNA,纯化后PCR法反转录合成cDNA。经SfiⅠ酶切,过凝胶柱层析,去除小于400 bp的片断,收集大于400 bp的cDNA片段,加工后与λTripIEx2连接,文库体外包装,取出一小部分感染宿主菌XL1-Blue MRF,检测文库容量;PCR分析插入的cDNA片段的大小及多样性。结果成功构建一个含有5×105重组子的葎草花粉表达文库,重组率为90%,平均插入片段长度约为1.02 kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选克隆的目的cDNA。