神经干细胞的分离培养与鉴定

目的　分离培养新生鼠神经干细胞并获得细胞克隆 ,同时建立良好的传代方法。方法　取新生大鼠大脑室管膜、脑室周围及海马细胞 ,经消化及机械吹打后接种于加有N2添加剂及生长因子的DMEM/F12 培养基 ,悬浮培养 ;用含血清而不含生长因子的培养基贴壁培养 ,促使分化 ;最后用免疫细胞化学方法进行染色鉴定。结果　分离培养的细胞多聚集生长 ,并形成细胞克隆 ,可以传代 ;细胞为圆形或椭圆形 ,经鉴定为nestin抗原阳性 ;分化后细胞分别表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性抗原。结论　分离培养的细胞具有自我更新和多向分化能力 ,表达神经干细胞的特异性抗原nestin ,是神经系统的干细胞。     

损伤反应性星形胶质细胞对成年大鼠室下区的再生作用

目的①观察液压性脑损伤后不同时期室下区Nestin和GFAP的表达及其细胞类型。②分离脑损伤室下区Nestin /GFAP 共存细胞进行培养、诱导分化鉴定。方法①用液压冲击法建立SD大鼠动物模型,用免疫组化和免疫荧光双标法分析和显示不同时期(1、3、5 d,1、2、3、4、6、8周)Nestin和GFAP的表达变化以及细胞类型。②分离液压损伤SD大鼠室下区Nestin /GFAP 共存细胞,制成单细胞悬液,进行培养、传代,以免疫荧光化学方法对原代和传代培养形成的神经球以及诱导分化的细胞进行鉴定。结果①室下区免疫荧光染色:正常组及空白对照组在前脑侧脑室SVZ区出现神经干细胞,主要集中在外侧壁上部和上角,其他部位及三脑室的SVZ区有少量神经干细胞。脑损伤模型组脑损伤24 h后,和正常组相比,室下区Nestin和GFAP的表达显著增加,阳性表达在3 d后逐渐达到高峰,持续1周。②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经球;神经球贴壁后分化的细胞表现为少突胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的形态,且分别呈GalC阳性、β-tublinⅢ阳性和GFAP阳性。结论①成年大鼠液压性脑损伤可诱导室下区表达Nestin和GFAP,Nestin的表达和反应性星形胶质细胞增生呈正相关,且表达多相互共存,并且具有星形胶质细胞的形态;室下区的星形胶质细胞和神经干细胞都对脑损伤都有反应,并可能参与中枢神经系统损伤修复。②成年大鼠液压性脑损伤后分离的室下区细胞具有自我更新能力和多分化潜能,可以分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,是中枢神经系统的干细胞。     

早期人胚神经干细胞分布及分离培养

目的　研究发育早期人胚脑神经干细胞的形态特征及其分布情况 ,并观察其体外生长分化特性。方法　计划生育流产的 6～ 12周胚胎大脑组织切片用vimentin抗体进行免疫组织化学染色 ,光镜观察。机械分离皮质细胞 ,用无血清培养基和含血清培养基进行悬浮和贴壁培养 ,分别用MAP2 、GFAP及GalC抗体进行免疫细胞化学染色 ,鉴定干细胞和神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结果　发育早期大脑Vimentin阳性细胞分布广泛 ,细胞形态单一 ,多呈圆球形 ,体积较小。体外培养的大脑皮质细胞在培养的第 5～ 7天时 ,形成较多克隆 ,可多次传代 ;贴壁培养时细胞发生分化 ,分别为MAP2 、GFAP、GalC阳性的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论　胚胎发育早期大脑神经干细胞分布广泛 ,形态单一 ,皮质Vimentin阳性细胞数量多 ,便于分离 ,是最佳神经干细胞分离部位 ;人NSCs可以在体外增殖并发生多向分化     

兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定;应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性.结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs,HE染色显示细胞均一性好;CD44强阳性表达,CD34阴性表达.诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性,ALP染色阳性;成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性,油红"O"脂肪染色阳性.结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力.     

人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究

目的 探讨并优化人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,为其进一步应用奠定基础.方法 用酶消化法分离培养hUCMSCs,通过传代培养、扩增,倒置光学显微镜及原子力显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖曲线,流式细胞仪检测免疫表型;体外向成骨、脂肪方向诱导分化,并通过特异性染色鉴定其分化能力.结果 采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs.接种24h,贴壁细胞形态多为长梭型、多边形或成纤维细胞样形态,大小均一.P3、P7代细胞的生长曲线基本一致,增殖能力强.流式细胞仪分析,第3代细胞强烈表达CD29、CD44、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR.经成骨诱导分化后4周,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节;经成脂诱导3周,油红O染色呈阳性,有明显的脂滴出现.结论 本实验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法.所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学形状稳定,并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,有望成为组织工程较为理想的种子细胞.     

大鼠来源脂肪干细胞的分离培养及其分化能力的检测

目的分离、培养及鉴定SD大鼠来源脂肪干细胞,为后续实验选取合适的种子细胞奠定基础。方法切取SD大鼠腹股沟处皮下脂肪,利用酶原消化合并差速贴壁的方法获得细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第3代细胞在成骨诱导液作用下向成骨方向分化,进行Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂方向分化,进行油红O染色。结果从大鼠脂肪组织获得的细胞,呈成纤维细胞样生长;经成骨诱导液培养后,表现出成骨细胞特性,Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;经成脂诱导液培养后,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后,胞浆内可见脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存2个月复苏后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论成功分离和培养大鼠脂肪干细胞,获得的细胞增殖旺盛,具有多向分化潜能,为后期运用组织工程技术修复组织损伤,提供了坚实的基础。     

小鼠肌源性干细胞的分离、培养及其分化能力检测

目的探讨小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的原代培养方法及其分化潜能,为肌性泌尿组织的细胞修复、治疗奠定基础。方法运用中性蛋白酶(DispaseⅡ)、胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法分离小鼠MDSCs,并运用差速贴壁法进行纯化。倒置显微镜下观察细胞形态,RT-PCR法鉴定MyoD及Desmin的表达,同时对分离的细胞进行成骨、成脂等分化诱导并鉴定。结果运用中性蛋白酶可很好地消化组织,差速贴壁法能得到纯度较高的MDSCs;RT-PCR检测发现MDSCs不表达MyoD以及Desmin,提示其为不同于肌卫星细胞的肌源性干细胞;成骨诱导检测碱性磷酸酶(ALP)染色(+),成脂诱导油红O染色(+);其可自体分化诱导为心肌样细胞,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白(cTnI)呈现阳性结果。结论利用此分离方法可获得纯度较高且具有较强分化潜能的肌源性干细胞,有助于进一步进行组织工程研究。     

多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案

目的探讨胚胎干细胞(ESCs)体外定向分化为胰岛祖细胞的分化潜能,应用多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高胚胎干细胞向胰岛祖细胞分化的效率。方法体外传代培养ESCs,采用逐步筛选分化方案,在不同的分化阶段,给予不同的生长因子诱导分化后,RT-PCR法检测胰腺特异性基因的表达,筛选最佳的诱导因子组合,并用免疫细胞化学方法鉴定相关特异蛋白的表达,从而建立体外高效的定向分化方案。结果从未分化ESCs定向分化为定形内胚层细胞,以活化素A诱导组的Sox17和Foxa2基因表达最显著;从定形内胚层细胞分化到后前肠细胞,以维甲酸+FGF10诱导组的Hnf4a和Hnf6基因表达最显著;从后前肠细胞定向分化到胰腺内胚层细胞,以维甲酸+环杷明+DAPT+Exendin 4诱导组的Pdx1、Ptf1a、Hblx9等胰腺特异性基因表达最显著;从胰腺内胚层细胞定向分化到胰岛祖细胞,以维甲酸+DAPT+Exendin 4诱导组的Ngn3、Nkx6.1、Pax4、Pax6等基因表达最显著。免疫细胞化学方法检测可见胰腺特异性的相关蛋白表达,多数Ngn3+细胞同时表达胰腺特异性基因Nkx6.1和Pdx1。结论应用多步骤诱导逐步筛选法可以建立高效的ESCs定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高ESCs向胰腺内胚层分化的分化效率,为1型糖尿病的β细胞再生治疗提供试验依据和可行性方案。     

人鼻咽癌放射抗拒性肿瘤干细胞的分离、筛选与鉴定

目的分离、筛选、鉴定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的肿瘤干细胞。方法免疫磁珠技术分选CNE-2及CNE-2R中鼻咽癌CD133+干细胞,分别用无血清培养法、平板克隆法、裸鼠成瘤试验检测分选的CD133+细胞体外增殖能力、克隆形成能力及成瘤能力,HE染色和电镜超微结构观察形态学变化。结果 CNE-2及CNE-2R细胞中CD133+表达分别为(1.79±0.16)%和(2.63±0.72)%;CNE-2-CD133+细胞及CNE-2R-CD133+细胞形成肿瘤干细胞球及体外增殖能力远高于CD133-表达者;CNE-2R-CD133+细胞克隆形成能力较CNE-2-CD133+细胞明显升高,而且CNE-2R-CD133+细胞的克隆形态与CNE-2-CD133+细胞相比较明显增大;形态学发现CNE-2R-CD133+细胞核大,异型,核仁大,细胞器肥大。结论分离、筛选出的鼻咽CNE-2R-CD133+肿瘤干细胞能形成干细胞球,其增殖能力、裸鼠成瘤能力更强,能为进一步探讨鼻咽癌放射抗拒的机制提供研究基础。     

脑外伤后T型钙通道对神经干细胞增殖的诱导作用

目的探讨脑外伤后T型钙通道对神经干细胞的诱导作用及其相关机制。方法构建成年大鼠脑损伤模型,分为手术组和手术+米贝地尔组(米贝地尔组),并另设正常对照组、假手术组。分离侧脑室壁的脑室下层(subventricular zone,SVZ)细胞,用神经干细胞悬浮培养法进行培养并鉴定其干细胞性质;在神经干细胞培养基中加入不同剂量的米贝地尔,通过计数神经干细胞球、噻唑蓝(MTT)法分析米贝地尔对神经干细胞增殖抑制作用,计算米贝地尔对神经干细胞的半抑制浓度(IC50),Western blot法检测脑组织中Cav3.2以及神经干细胞中Cav3.2、Cyclin A和caspase-3的蛋白表达。结果体内实验表明,手术组中神经干细胞的增殖能力显著高于正常对照组和假手术组,应用米贝地尔腹腔注射抑制脑组织中T型钙通道后,神经干细胞的增殖明显降低。体外细胞实验表明,米贝地尔能够明显抑制神经干细胞球的形成,MTT法显示米贝地尔浓度大于5μmol/L时,可显著抑制细胞增殖,5、10、20μmol/L组的吸光度(A值)与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。IC50值为8.93μmol/L。Western blot检测结果显示,米贝地尔组的Cav3.2蛋白和Cyclin A蛋白的表达显著降低,caspase-3蛋白的表达显著升高。结论脑外伤后可激活脑组织中T型钙通道,上调神经干细胞的增殖能力。     

PROPERTIES OF PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF NEONATAL RAT RETINAL PROGENITOR CELLS IN VITRO

Objective To investigate the properties of proliferation and differentiation of neonatal rat retinal progenitor cells （RPCs） in vitro. Methods RPCs were isolated from neonatal SD rats neural retina and cultured in DMEM/F12 ＋ N2 with EGF and bFGF （suspension medium ） or 10 % FBS without EGF and bFGF （ differentiation medium）. The cells grew as suspended spheres or adherent monolayers, depending on different culture conditions. The neural stem cells or retinal progenitors, neurons, astrocytes, retinal ganglion cells, rod photoreceptors and the proliferating cells were evaluated with immunofluorescence analysis by Nestin or Pax6, Map2, GFAP, Thy-1, Rhodopsin and BrdU antibodies respectively. Results RPCs could propagate and differentiate in suspension or differentiation medium and express the markers of Nestin （92.86%） or Pax6 （86.75%）, Map2 （38.54%）, GFAP （20.93%）, Thy-1 （27. 66%） and Rhodopsin（13. 33%）in suspension medium; however, Nestin （60.27%）, Pax6 （52%）, Map2 （34.94%）, GFAP （38.17%）, Thy-1 （30.84%） and Rhodopsin （34.67%） in differentiation medium. 96.4 % of the population in the neurospheres was BrdU-positive cells. The cells could spontaneously adherent forming some subspheres and retinal specific cell types. Conclusion Neonatal rat RPCs possess the high degree of proliferation and can differentiate into neurons, astrocytes, retinal ganglion cells and rod photoreceptors in vitro. There are different proportions for RPCs to differentiate into specific cell types.     

Identification and culture of neural stem cells isolated from adult rat subventricular zone following fluid percussion brain injury

Objective To analyze proliferation and differentiation of glial fibrillary acid protein (GFAP)- and nestin-positive (GFAP+/nestin+) cells isolated from the subventricular zone following fluid percussion brain injury to determine whether GFAP+/nestin+ cells exhibit characteristics of neural stem cells. Methods Male Sprague-Dawley rats, aged 12 weeks and weighing 200-250 g, were randomly and evenly assigned to normal control group and model group. In the model group, a rat model of fluid percussion brain injury was established. Five days later, subventricular zone tissue was resected from each group and made into single cell suspension. After serum-free neural stem cell medium culture and subsequent serum-induced differentiation, cell type, proliferation and differentiation capacities were determined by immunofluorescence staining and flow cytometry. Results At 3-7 days after fluid percussion brain injury, nestin+/GFAP+ cells in the single cell suspension from the model group significantly outnumbered those from the normal control group (P<0.01). In the model group, an increased number of small neurospheres with smooth cell edge and bulged center formed after primary culture, and were clearly visible with the increase of culture time and medium replacement. After several passages, many clonal spheres were obtained, suggesting strong self-proliferatiing capacity. Neurospheres from the model group differentiated into astrocytes, neurons and oligodendrocytes. Conclusion GFAP+/nestin+ cells isolated from the adult rat subventricular zone after fluid percussion brain injury are thought to be neural stem cells because of their self-renewal and multi-differentiation capacities.     

不同生长期晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞存活的促进作用

目的观察不同生长期大鼠的晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)是否具有不同的保护作用。方法分别提取出生后1 d、2周、6月、1年期的SD大鼠晶状体可溶性蛋白,加入培养的RGCs中,观察其对RGCs存活时间、突触生长状况及凋亡的影响。结果同期提取的晶状体蛋白各不同浓度作用于RGCs,促进其存活的作用有差异,最佳有效浓度为10-5g/L。不同生长期大鼠的晶状体蛋白可以延长RGCs存活时间,并随生长期增长而延长,但1 d组与2周组无显著性差异。加入晶状体蛋白后RGCs凋亡减少,随生长期增长而逐级减少。结论晶状体可溶性蛋白可显著促进离体培养的RGCs的存活和生长,晶状体蛋白的最佳有效质量浓度为10-5g/L。不同生长期晶状体蛋白的神经保护作用有所不同,随生长期延长,作用逐渐增强。     

全反式维甲酸对NT2细胞系胶质瘤趋向性的影响

目的研究全反式维甲酸(ATRA)对NT2细胞系胶质瘤趋向性的影响。方法将NT2细胞分为4组:NT2组(未经ATRA干预)、NT2RA1周组(ATRA干预1周)、NT2RA2周组(ATRA干预2周)、NT2RA3周组(ATRA干预3周),采用细胞迁移分析的方法,分别检测其对U87胶质瘤细胞、无血清DMEM培养基以及含100mL/L胎牛血清DMEM培养基的趋向性。结果经ATRA干预的NT2细胞,其胶质瘤趋向性较未经干预组(NT2组)显著提高(P<0.05),对非特异性迁移趋化物如血清等的迁移则较未经干预组显著减少(P<0.05),其中NT2RA2周组胶质瘤趋向性最强,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论经ATRA干预2周的NT2细胞其胶质瘤特异趋向性显著提高,有望成为临床治疗胶质瘤的新型靶向基因传递载体。     

钙依赖途径在高糖致心肌细胞肥大中的作用

目的探讨体外培养条件下钙调神经磷酸酶(CN)和钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是否参与高糖诱导的心肌细胞的肥大反应。方法新生SD大鼠心肌细胞在含150mL/L的新生牛血清培养48h后,换用无血清培养基培养24h,然后用正常糖(5.5mmol/L的D-葡萄糖)、高糖(25mmol/L的D-葡萄糖)和等渗糖(5.5mmol/L的D-葡萄糖+19.5mmol/L的L-葡萄糖)分别培养48h。检测心肌细胞肥大指标:表面积和蛋白含量;用钙成像技术研究其钙瞬变特点;以及利用CN和CaMKⅡ的阻断剂CsA和KN93验证两种酶在肥大过程中的作用。结果与正常糖组和等渗对照组相比,高糖可以诱导心肌细胞肥大和钙超载,增加了心肌细胞的表面积和蛋白含量。CsA和(或)KN93可明显抑制心肌细胞的肥大。结论 CN和CaMKII在高糖诱导的心肌细胞肥大过程中发挥重要的作用。     

机械性脑白质损伤后皮层神经元凋亡的证据及其分布特征

目的　探讨细胞凋亡在机械性脑白质损伤后皮层神经细胞病理变化中的作用及其分布特征。方法　雄性健康SD大鼠 3 6只随机分为假手术组 (1 2只 )和模型组 (2 4只 ) ,用模型组动物制作大脑皮层下横切模型。于致伤后不同时间处死动物 ,用TUNEL原位末端标记和常规病理组织学方法观察损伤区及相应皮层神经细胞变化的性质和规律。结果　致伤后横切处出血 ,损伤组织内神经元出现坏死改变 ,胶质细胞增多。大脑皮层Ⅱ Ⅴ层神经细胞多出现萎缩改变。伤后 1 2d时 ,相应皮层内即出现散在早期凋亡神经元 ,随后逐渐增多 ,7d后又趋减少 ,伤后 1 9d皮层内仍可检出凋亡神经元。在损伤区凋亡神经元少见 ,可见部分胶质细胞凋亡。结论　脑白质损害时 ,损伤相应部位皮层神经元主要表现为凋亡。在损伤区 ,神经元和胶质细胞主要表现为坏死。皮层内凋亡神经元主要分布于第Ⅱ Ⅴ层 ,其时间分布呈一单峰状曲线 ,凋亡峰出现在伤后第 7d前后 ,至少持续 1 9d。     

体外诱导人脐血CD34~+细胞向肝细胞的分化

目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化。方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/L FBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导。分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞。通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度。结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度>90%,达到分离要求。RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA。免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P<0.01)。结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞。     

SP和Con A对培养的大鼠皮肤肥大细胞组胺释放的影响

用酶消化法获得大鼠皮肤肥大细胞，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液。培养1d后，在培养液中加入不同浓度的SP、SP＋Ca2+或ConA，继续培养不同时间。用微孔滤膜迅速分离细胞和培养液，荧光法测定培养液中的组胺含量，计算组胺释放率。结果显示，SP和ConA均能以时间和剂量依赖性方式刺激体外培养的大鼠皮肤肥大细胞释放组胺，并且SP的这种作用明显地受Ca2+浓度的影响。