大骨节病关节软骨细胞形态及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13表达的体外研究

目的体外培养大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)患者和正常对照的关节软骨细胞并对比观察细胞形态、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅹ型胶原表型及基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达变化,以明确KBD软骨细胞的生长特性。方法依据我国"大骨节病临床诊断标准"和病理学变化特征,选择KBD患者为KBD组(n=8),并设立正常对照组(n=8)。在无菌手术条件下采集关节软骨,胶原酶等消化、分离后进行软骨细胞培养,光镜及透射电子显微镜观察形态,免疫组织化学及流式细胞术观察细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原和MMP-13的体外表达变化,对比研究KBD软骨细胞表型表达的特点。结果KBD软骨细胞内空泡及核变形现象较正常增多,并有绒毛及胶原纤维不规则排列等超微结构变化。两组间Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅹ型胶原表型表达差异显著,其中KBD组Ⅱ型胶原表型表达显著低于对照组(t=-5.54,P<0.001),而MMP-13表达显著增高(t=3.70,P<0.01)。结论KBD软骨细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ、Ⅹ型胶原表型和MMP-13的表达不同于正常对照组,以软骨细胞的退行性和增生性变化为著。     

大骨节病关节软骨细胞形态及工、Ⅱ、Ⅲ、X型胶原表型和MMP-13表达的体外研究

目的体外培养大骨节病（Kashin-Beckdisease,KBD）患者和正常对照的关节软骨细胞并对比观察细胞形态、I、Ⅱ、Ⅲ和X型胶原表型及基质金属蛋白酶13（MMP-13）的表达变化,以明确KBD软骨细胞的生长特性。方法依据我国“大骨节病临床诊断标准”和病理学变化特征,选择KBD患者为KBD组（n=8）,并设立正常对照组（n=8）。在无菌手术条件下采集关节软骨,胶原酶等消化、分离后进行软骨细胞培养,光镜及透射电子显微镜观察形态,免疫组织化学及流式细胞术观察细胞I、Ⅱ、Ⅲ、X型胶原和MMP-13的体外表达变化,对比研究KBD软骨细胞表型表达的特点。结果KBD软骨细胞内空泡及核变形现象较正常增多,并有绒毛及胶原纤维不规则排列等超微结构变化。两组间I、Ⅱ、Ⅲ、X型胶原表型表达差异显著,其中KBD组II型胶原表型表达显著低于对照组（t=-5．54,P〈O．001）,而MMP-13表达显著增高（t=3．70,P〈O．01）。结论KBD软骨细胞I、Ⅱ、Ⅱ、X型胶原表型和MMP-13的表达不同于正常对照组,以软骨细胞的退行性和增生性变化为著。     

海藻酸盐小球中培养的软骨细胞的生长

目的为海藻酸盐水凝胶作为软骨细胞三维培养环境提供实验依据。方法将酶消化法获取的P1代软骨细胞包裹在20 g/L海藻酸钙凝胶小球中持续培养4周,在培养的不同时间点取适量的小球行倒置相差显微镜观察,HE、番红"O"染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色;并通过MTT法检测细胞活性及增殖;二甲基亚甲兰法进行氨基葡聚糖(GAG)含量测定。结果在海藻酸钙小球内培养的软骨细胞能够保持球形状态,且随时间的延长,细胞增殖逐渐聚集成簇;细胞外基质沉积逐渐增加,GAG含量增多。Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,鉴定证实为具有正常表型的软骨细胞。结论软骨细胞在海藻酸盐凝胶小球中培养有效维持了细胞的分化状态,细胞增殖并具有良好的分泌蛋白功能。海藻酸钙凝胶适合于软骨细胞的生长。     

脱钙松质骨体外构建组织工程软骨的实验研究

目的软骨细胞复合同种异体脱钙松质骨(demineralized cancellous bone,DCB)体外构建组织工程软骨,评价DCB作为组织工程软骨支架的可行性。方法取新西兰兔长骨干骺端松质骨制备DCB,扫描电镜观察;分离幼兔关节软骨细胞,原代培养后种植在同种异体DCB体外培养,分别于7、14、21、28、35、42d取材进行苏木素-伊红(HE)、甲苯胺蓝(TB)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原染色。结果制备的DCB成三维立体多孔结构,孔隙大小100~500μm,有良好的可塑性和一定的力学强度;软骨细胞在DCB表面和空隙内生长、分化良好,形成软骨陷窝,分泌基质蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。培养42d软骨细胞在DCB表面及孔隙内形成软骨样组织。结论 DCB复合同种异体软骨细胞在体外成功构建了组织工程软骨,是一种较理想的软骨组织工程支架材料。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的　建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法 ,诱导其表达软骨细胞表型。方法　抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导 ,观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果　①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁 ,可提高细胞分离率 ;②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合可促进MSCs增殖 ,表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论　①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖 ,表达软骨细胞表型     

低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

目的利用低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞定向分化。方法分离人骨髓,利用梯度离心法进行MSCs的培养,取第三代细胞利用低强度间断负压诱导分化;倒置显微镜下观察细胞的形态,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色观察钙结节形成,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达。结果低强度间断负压诱导2周后,细胞呈现出成骨细胞形态,ALP活性明显增强,茜素红染色可见钙结节形成,Ⅰ型胶原和骨保护素表达阳性。结论利用低强度间断负压可以成功的诱导MSCs向成骨细胞定向分化,诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。     

DON毒素和硒对软骨聚集蛋白聚糖硫酸化修饰的影响

目的研究大骨节病(Kashin-Beck disease,KBD)可疑致病因子脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和补硒对软骨细胞外基质聚集蛋白聚糖(aggrecan)硫酸化修饰的影响。方法应用体外单层培养C28/I2人软骨细胞,采用MTT法测定不同浓度DON和不同作用时间下的细胞增殖活性,通过Real-time PCR和Western-blot法分别检测加DON毒素或补硒后软骨细胞的aggrecan、PAPS合成酶2(PAPS synthetase 2,PAPSS2)、PAPS转运体1(PAPS transporter 1,PAPST1)、N-乙酰氨基半乳糖胺-4,6-硫酸转移酶[carbohydrate(N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O)sulfotransferases 15,CHST15]以及芳基硫酸酯酶B(arylsulfatase B,ARSB)mRNA和蛋白的表达水平。结果 DON毒素可抑制C28/I2软骨细胞系的增殖活性,在DON毒素作用下aggrecan、PAPSS2、PAPST1和CHST15的mRNA和蛋白质表达水平降低,ARSB mRNA和蛋白质表达水平升高,加硒可在一定程度上改善这种状况。结论 DON毒素对软骨细胞的增殖有明显的抑制作用,细胞对毒素有一浓度和时间的依赖性;DON毒素可通过改变aggrecan硫酸化修饰相关酶类的表达水平影响软骨蛋白聚糖的硫酸化。     

髓核内注射骨髓间质干细胞对椎间盘基质的影响

目的研究髓核内注射骨髓间质干细胞对椎间盘基质的影响。方法32只新西兰大白兔,L2-3、L3-4、L4-5、L5-6被随机分为正常对照组、生理盐水对照组、细胞移植组Ⅰ、细胞移植组Ⅱ(BMP2转基因组)。髓核内注射后1、3、6月时间点,用Ⅰ、Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组化染色分析胶原表型的改变,用实时荧光定量PCR分析Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白多糖的mRNA表达,采用重复测量方差分析进行统计学分析。结果术后1、3、6月时间点,细胞移植组髓核有较多的细胞,蛋白多糖染色显示细胞移植组髓核兰染增加,免疫组化显示Ⅰ型胶原实验各组未见明显差异,Ⅱ型胶原细胞移植组有较强的红染颗粒沉积。实时荧光定量RT-PCR分析显示,在细胞移植组,蛋白多糖和Ⅱ型胶原的mRNA增加,而Ⅰ型胶原mRNA则无改变。与细胞移植组Ⅰ比较,细胞移植组Ⅱ蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA增加。结论骨髓间质干细胞移植能够提高髓核中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量,复合BMP2转基因有"分子增强效应",提示基于骨髓间质干细胞移植策略是治疗椎间盘退变潜在的有效方法。     

人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究

目的 探讨并优化人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,为其进一步应用奠定基础.方法 用酶消化法分离培养hUCMSCs,通过传代培养、扩增,倒置光学显微镜及原子力显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖曲线,流式细胞仪检测免疫表型;体外向成骨、脂肪方向诱导分化,并通过特异性染色鉴定其分化能力.结果 采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs.接种24h,贴壁细胞形态多为长梭型、多边形或成纤维细胞样形态,大小均一.P3、P7代细胞的生长曲线基本一致,增殖能力强.流式细胞仪分析,第3代细胞强烈表达CD29、CD44、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR.经成骨诱导分化后4周,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节;经成脂诱导3周,油红O染色呈阳性,有明显的脂滴出现.结论 本实验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法.所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学形状稳定,并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,有望成为组织工程较为理想的种子细胞.     

组织工程修复软骨基质蛋白聚糖代谢的初步探讨

目的 检测软骨修复组织中蛋白聚糖相关代谢指标,初步探讨在软骨修复过程中基质蛋白聚糖的代谢变化以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和蛋白聚糖酶(aggrcanases)的作用.方法 松质骨骨基质明胶(bone matrix gelatin, BMG)复合同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨,体内植入修复兔膝关节骨软骨缺损.术后6个月取材检测蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、MMPs裂解表位BC-4 以及aggrcanases裂解表位BC-13的表达情况.结果 在修复组织中,蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)表达增加,MMPs及其裂解表位BC-4表达减低,而aggrcanases裂解表位BC-13表达阴性.结论 利用蛋白聚糖合成表位3-B-3(-)、MMPs、BC-4、BC-13的表达情况可以初步了解修复软骨组织中蛋白聚糖的代谢变化,修复软骨组织蛋白聚糖的合成大于分解,MMPs在兔关节修复软骨基质蛋白聚糖的基础代谢和重塑中具有重要作用.     

EFFECT OF LOW SELENIUM ON CHONDROCYTE DIFFERENTIATION AND DIFFERENTIAL EXPRESSION OF COLLAGEN TYPES Ⅰ , Ⅱ AND X IN ARTICULAR CARTILAGE FROM MINI-PIGS

Objective According to the distribution of low selenium areas, low nutrition state of the residents and the affecting cartilage growth and articular cartilage of Kashin-Beck Disease(KBD),the chondrocyte differentia- tion and differential expression of collagen types Ⅰ , Ⅱ and Ⅹ in articular cartilage from Chinese mini-pigs treated with low selenium were investigated in order to gain insight into the effects of these conditions on chondrocyte differ- entiation in KBD cartilage. Mothods Eleven male juvenile mini-pigs, aged from 4 weeks to 6 weeks after birth, were divided into 3 groups. The Se content in the diet of the “low Se” group was 0. 035mg/kg diet, and 0. 175 mg/kg diet in the control. For Se-supplemented group 0. 390mg /kg diet was added. The content of Se in blood was assayed at the beginning and at the end of each experiment. Samples of articular cartilage were taken from the right femur condylus, and collagen types Ⅰ , Ⅱ and Ⅹ in articular cartilage were analyzed by immunohistochemistry and in situ hybridization. Results ①All cartilage samples from juvenile mini-pigs fed with low selenium diet revealed a re- duction in type Ⅹ collagen mRNA expression in the hypertrophic chondrocytes as shown by in situ hybridization, and reduced type Ⅹ collagen deposition in the lower hypertrophic zone as shown by immunohistochemistry. ②Addition of selenium to the diet restored the type Ⅹ collagen to normal level. ③Type Ⅱ collagen was evenly distributed over the entire articular cartilage in all experimental and control groups. Type Ⅱ collagen mRNA signals were most prominent in the upper articular layer as well as in the hypertrophic zone in all groups. Type Ⅱ collagen expression was restrict- ed to the zone of endochondral ossification in all experimental groups and the control. Conclusion Low selenium has an down-regulatory role on the synthesis and deposition of collagen type Ⅹ in hypertrophic chondrocytes in articular cartilage of mini-pigs. Supplement of the low Se diet with additional Se restored the signals of collagen type Ⅹ to nor- mal levels. These findings indicate that selenium deficiency may disturb chondrocyte differentiation to hypertrophic cells in the growth plate,and worthy to be investigated further.     

GROWTH DIFFERENTIATION FACTOR-5 STIMULATES THE GROWTH AND ANABOLIC METABOLISM OF ARTICULAR CHONDROCYTES

Growthdifferentiationfactor5(GDF5),also knownascartilage derivedmorphogeneticprotein1(CDMP1),isamemberofthebonemorphogenet icprotein(BMP)familywhichbelongstothe transforminggrowthfactorβ(TGFβ)superfami ly[1].GDF5isarelativelynewmemberofthe BMPfamily.LikeotherBMPs,implantationofre combinantGDF5caninduceectopiccartilagefor mationinmusculartissues.Thephysiologicalrole ofGDF5hasbeenreportedincludingregulationof myogenesis,regulationofchondrogenesis,bone morphogenesis,andneurondifferen…     

腹股沟疝患者腹直肌后鞘Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量的初步分析

目的分析腹股沟疝患者腹直肌后鞘Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例的变化。方法切取104例开腹手术患者腹直肌后鞘组织,其中合并腹股沟疝者16例,应用免疫组织化学方法(SABC法)进行染色,比较Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量、胶原总量及Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白比例在腹股沟疝组和非腹股沟疝组间的差异。结果腹股沟疝组Ⅰ型胶原含量降低,Ⅲ型胶原含量升高,胶原总量升高,Ⅰ型/Ⅲ胶原蛋白比例降低。结论腹股沟疝患者腹直肌后鞘的Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例下降,Ⅰ型胶原含量降低,而Ⅲ型胶原含量增高。腹股沟疝可能是系统性胶原代谢紊乱在腹股沟区的局部表现。     

血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛眼小梁细胞间质合成的影响

目的　观测血管紧张素Ⅱ对体外培养的牛小梁细胞间质合成的影响 ,探讨原发性开角青光眼的发病机制。方法　①体外培养牛眼小梁细胞 ,应用免疫组化方法 (NSE ,Ⅷ因子相关抗原染色 )鉴定细胞 ,光学及电子透射显微镜对细胞进行形态学及生长特性的观察 ;②AngⅡ (1×1 0 -7mol·L-1及 1× 1 0 -8mol·L-1)及其Ⅰ型受体拮抗剂孵育牛眼小梁细胞 ,免疫荧光染色测定纤维粘连蛋白 ,并用化学方法检测培养液中羟脯氨酸含量间接推导胶原含量。结果　牛眼小梁细胞培养成功 ,以上皮型为主。AngⅡ明显地增加了牛眼小梁细胞纤维粘连蛋白 ,同时培养液中的羟脯氨酸含量亦相应增高 (P <0 0 5 )。结论　体外培养牛眼小梁细胞技术是研究小梁细胞特性的重要实验技术。AngⅡ可以促进纤维粘连蛋白、胶原合成增强 ,AT1受体拮抗剂可以部分阻断此促增殖效应。     

Ⅰ型胶原及NF-κB与动脉粥样硬化关系的实验研究

目的探讨动脉粥样硬化(AS)时血脂成分的改变以及Ⅰ型胶原mRNA与其蛋白、NF-κBmRNA与其蛋白在兔AS发生中的作用及其机制,为临床预防及治疗AS斑块提供新的理论依据。方法采用HE、免疫组化及原位杂交法染色,光镜观察AS病变,并应用CMIAS真彩色医学图像分析系统分析;检测40只食饵性AS新西兰兔血脂成分的改变及血管壁的病理变化、Ⅰ型胶原mRNA与其蛋白、NF-κBmRNA与其蛋白的表达情况。结果实验兔15周时血胆固醇(TC)升高约43倍,血低密度脂蛋白(LDL)升高约37倍。主动脉内壁可见脂质条纹形成。主动脉AS病变Ⅰ型胶原、NF-κB蛋白及Ⅰ型胶原mRNA、NF-κBmRNA表达定量(A值)分别为0.27±0.02、0.19±0.01及0.30±0.03、0.35±0.03,显著高于对照组(0.08±0.01、0.09±0.01及0.11±0.01、0.10±0.09,P<0.05)。结论AS时Ⅰ型胶原增多刺激NF-κB的活性,可能参与了血管AS的形成。     

人晶状体上皮细胞原代培养方法的改进

目的 建立一种简单有效的人晶状体上皮细胞体外培养的方法.方法 用组织块培养法,采用连续花瓣状撕囊法获得人白内障患者的晶状体前囊膜,使用含有表皮生长因子的培养液进行培养,对培养的细胞进行形态学观察及鉴定;在倒置相差显微镜下观察其生长规律,应用免疫荧光组织化学法进行鉴定.结果 体外培养的原代人晶状体上皮细胞在组织块贴壁24 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点.αA-晶状体蛋白抗体阳性率几乎100％,鉴定为晶状体上皮细胞.结论 采用连续花瓣状撕囊法获得的组织块较易在体外培养出入晶状体上皮细胞,可用于白内障后囊膜混浊发病机制的进一步研究.     

不同亲和力ACEI干预对MI后心肌胶原重建的影响

目的　利用对心肌ACE亲和力较低的伊那普利及较高的培哚普利干预探讨心肌梗塞后间质Ⅰ、Ⅲ型胶原重建同心内RAS、循环RAS的关系 ,并试图为临床用药提供一定参考资料。方法　采用免疫组化结合自动图象分析系统 ,借助对心肌不同亲和力的ACEI药物干预观察Ⅰ、Ⅲ型胶原变化。结果　MI后两种不同ACEI对非梗塞区胶原作用不同 ,对心脏ACE高亲和力的培哚普利可明显抑制NIA胶原Ⅰ、Ⅲ型重建 ,而低亲和力的伊那普利则不能。两药对梗塞区胶原Ⅰ、Ⅲ型含量和比例均无显著作用。结论　不同亲和力的ACEI对MI后心肌胶原作用的不同可能是由二者对心肌ACE亲和力差别所致 ,提示MI后间质胶原重建同心脏局部RAS关系密切 ,而循环RAS所起作用不大。     

慢性肝病患者血清Ⅰ、Ⅲ型胶原变化及其意义

应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了139例慢性肝病患者及30例正常对照血清Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。结果发现，在慢迁肝、慢活肝及肝硬化各组其含量逐渐上升，Ⅰ型胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值能更好地反映肝纤维化程度。相关性分析表明二者与反映肝细胞损伤指标均不相关。提示Ⅰ型胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原比值是判定肝纤维化状况的较可靠指标。     

缓激肽在依那普利干预心肌梗塞大鼠心肌胶原代谢中的作用

目的　探讨缓激肽 (BK)对大鼠心肌梗塞 (MI)后心肌胶原生化改建的影响 ,以及血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI)对心肌胶原的影响是否与抑制BK的降解有关。方法　复制大鼠MI模型后 ,第 3天开始给予依那普利(5 0 0 μg·kg-1·d-1) 4周 ,测定左心室非梗塞区组织的胶原含量及Ⅰ、Ⅲ型胶原的比值 (Ⅰ /Ⅲ ) ,并与依那普利 +BKB2 受体阻断剂HOE 14 0 (5 0 0 μg·kg-1·d-1由微渗透泵给入 )组、血管紧张素ⅡⅠ型受体 (AT1)阻断剂Losartan(3mg·kg-1·d-1)组及对照组相比较。结果　依那普利、Losartan组的胶原含量及其Ⅰ /Ⅲ比值均较对照组降低(P <0 0 5 ) ,而Losartan组的胶原含量及其Ⅰ /Ⅲ比值又低于依那普利组 (P <0 0 5 ) ,依那普利 +HOE 14 0组的胶原含量及Ⅰ /Ⅲ比值较单独用依那普利组明显升高 (P <0 0 5 )。结论　BK能抑制大鼠MI后左心室胶原的生成及降低胶原Ⅰ /Ⅲ比值 ;ACEI阻抑左心室胶原生化改建的作用机制是既抑制了血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )的生成又促使了心肌局部BK的积累。