角膜基质脱细胞处理与相容性实验研究

目的寻找有效适宜的脱细胞方法对猪角膜进行处理,制备角膜生物支架材料。方法利用胰酶和胶原酶消化结合液氮冻融的方法对猪角膜基质进行处理,60Co消毒,冻干保存。经组织学观察、细胞培养附和与动物移植检验其生物特性。结果获得的脱细胞角膜基质,显微结构观察显示板层结构完整,胶原纤维间组织结构疏松,未见细胞残留,整个基质成网状结构,在上皮面保存有完整连续的基底膜。细胞培养附和实验观察到种子细胞可以在基质上良好生长。动物移植实验未见明显的炎症反应与排斥。结论经该法脱细胞处理后得到的角膜基质无细胞毒性,组织相容性好,可以成为适宜的组织工程支架材料。     

大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验

目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,进行骨向分化诱导,并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨,为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,MSCs能够向成骨细胞分化,骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。     

骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定

目的建立兔骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法抽取兔胫骨骨髓,密度梯度离心,得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性。通过免疫荧光组织化学、流式细胞分析和透射电镜鉴定细胞。结果分离培养的骨髓MSCs贴壁、呈梭形,原代细胞呈集落生长,7～10d达到融合,传代后增殖速度加快;骨髓MSCs表达CD90,反复传代后表达效率增高,不表达CD34;透射电镜可见细胞表面有大量的绒毛突起,胞浆中有丰富的粗面内质网和线粒体,核大,形态不规则。结论密度梯度离心结合贴壁法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,分离培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。     

TGF-β诱导骨髓干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)对骨髓间充质干细胞(MSCs)定向分化为心肌样细胞的影响。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用TGF-β1对第二代MSCs定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学技术检测诱导后4周MSCs结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白T(CTnT)及p38MAPK的表达情况,并根据CTnT这一心肌源性特异性标记物的阳性率,分析心肌细胞的转化率;同时,以半定量RT-PCR方法在诱导后7、21、28d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性肌凝蛋白重链α-MHC的表达。结果①加入TGF-β1诱导后的MSCs,于7d时形态已转变成类长柱形,28d时细胞体积则变小,呈条梭状排列,可观察到类肌管样结构。②TGF-β1诱导4周后的MSCs均可见desmin、α-sarcomeric actin及p38MAPK阳性细胞。诱导组的心肌样细胞转化率均显著高于对照组(P均<0.01)。③RT-PCR结果显示,诱导组细胞GATA-4于诱导后7d弱表达,21d表达增强,28d表达减弱。α-MHC在诱导后7d不表达,21d弱表达,28d表达明显。结论骨髓间充质干细胞在TGF-β诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

共存递质囊泡循环动力学研究细胞模型的建立

目的直接证明PC12细胞能够合成和分泌组胺(histamine,HA),为将其应用于交感神经共存递质囊泡循环动力学研究提供实验依据。方法常规培养PC12细胞,用嵌套RT-PCR(nRT-PCR)和Western blot技术检测其合成HA的关键酶组氨酸脱羧酶(histidine decarboxylase,HDC)的mRNA和蛋白表达,利用免疫荧光技术观测HA、HDC以及HA囊泡在细胞中的定位。结果从基因和蛋白水平均证实了该细胞中表达HDC,并利用形态学方法在细胞中检测到HA、HDC以及HA囊泡的存在。结论 PC12细胞确实含有HA,结合分化型PC12细胞与交感神经元相似的特征,可将其作为交感神经共存递质囊泡循环动力学研究的理想细胞模型。     

体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化

目的 建立体外非接触共培养模型,诱导小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肺泡上皮细胞的分化.方法 分三组,每组6例.对照组:小鼠MSCs单独培养组;实验组A:正常肺组织单细胞悬液+MSCs;实验组B:损伤肺组织单细胞悬液+MSCs.共同培养8d,激光共聚焦和RT-PCR检测共培养体系下室中的SP-C和AQP5的表达情况.结果 对照组和实验组A都只检测到AQP5;而实验组B可同时检测到AQP5和SP-C.实验组B的AQP5 mRNA的表达量较对照组明显增多(P<0.01),而与实验组A比较,其AQP5 mRNA的表达量也有统计学差异(P<0.01).但是,实验组A与对照组比较则无明显统计学差异(P>0.05).结论 本实验室成功建立了体外非接触诱导小鼠MSCs分化为肺泡上皮细胞的实验模型.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率。方法应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs,贴壁法不断纯化,流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达,然后用pEGFP-N3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率。结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形,有聚集生长的倾向,多3~5个细胞成为一个集落。传代后,细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样,长梭形,胞浆突起较少,胞体轮廓不甚清晰,胞体也相对较大;②GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达最强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达;③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关,1∶2到1∶3最高。结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;GFP转染是一种较好的MSCs标记方法。     

雄黄对急性早幼粒细胞白血病细胞诱导凋亡和促进分化的双重作用

目的　了解雄黄治疗急性早幼粒细胞白血病 (APL)的机制。方法　以APL细胞株NB4细胞为体外模型 ,应用透射电镜观察细胞形态 ,MTT检测细胞生长增殖状态 ,流式细胞仪检测细胞凋亡 ,NBT还原试验反映细胞分化能力 ,并检测细胞表面分化抗原CD11b、CD3 3 表达的改变。结果　雄黄作用后 ,细胞同时出现凋亡和分化相关的形态改变 ;超微结构发现凋亡小体 ,同时部分细胞内出现分化颗粒 ;流式细胞仪检测线粒体膜表面抗原APO 2 .7表达上调 ;CD11b表达增加 ,CD3 3 表达减少 ,其调变程度弱于全反式维甲酸。结论　雄黄对急性早幼粒细胞白血病细胞同时具有诱导凋亡和促进部分分化的双重效应。     

自制磷酸钙骨水泥人工骨的生物安全性

目的　评价自制磷酸钙骨水泥人工骨 (CPC)的生物相容性。方法　将CPC人工骨制成生理盐水浸提液 ,培养L 92 9细胞 ,观察浸提液对L 92 9细胞生长和相对增殖度的影响 ,评价CPC人工骨对细胞的潜在毒性作用 ;将CPC人工骨制成一定大小和形状植入新西兰兔股部肌肉 ,观察植入后不同时期试样周围组织反应程度 ,评价CPC对组织的刺激性和相容性。结果　CPC对L 92 9靶细胞未见毒性作用 ;植入后对周围组织、肌肉无刺激反应。结论　CPC人工骨有良好的生物相容性     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的　建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法 ,诱导其表达软骨细胞表型。方法　抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导 ,观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果　①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁 ,可提高细胞分离率 ;②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合可促进MSCs增殖 ,表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论　①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖 ,表达软骨细胞表型     

ISOLATION AND INDUCTION OF RABBIT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS TO EXPRESS CHONDROCYTIC PHENOTYPE

Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＭＳＣｓ)ｗｅｒｅｍｕｌｔｉｐｏ ｔｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｓ ,ｌｏｃａｔｅｄｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ,ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓ ｃｌｅａｎｄｓｙｎｏｖｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅ ,ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｔｅｉｎｔｏｓｅｖｅｒａｌｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌｓ,ｓｕｃｈａｓｏｓｔｅｏｃｙｔｅ ,ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅａｎｄａｄｉｐｏｃｙｔｅ[1,2 ] .ＳｅｐｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＣｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｖｅｎｉｅｔ ,ａｕｔ…     

Preliminary characteristic of alginate,heparin-chitosan-alginate,heparin microencapsulated hepatocytes system

Alginate, low mole mass heparin-chitosan-alginate, low mole mass heparin microcapsules (ALCAL) with good mechanical stability were made from the high voltage pulsing microcapsule shaping device. ALCAL was made of low-mole-mass heparin (LMWH), alginate (ALG) and chitosan (CS) by supramolecular layer upon layer self-assembled technique. It was found from the microscopic observation that the microcapsules had smooth surface and a porous structure with interconnected pores. The results of the permeability experiment of microcapsules using fluorescein isothiocyanate-bovine serum albumin (FITC-BSA) and fluorescein isothiocyanate-immunoglobulin G (FITC-IgG) showed that the ALCAL membrane could provide cell immuno-isolation; meanwhile, the ALCAL membrane had good biocompatibility. The potential of ALCAL microcapsules for the encapsulation of liver cells had been investigated and showed that the ALCAL membrane supports the survival, proliferation and protein secretion on encapsulating hepatocytes. The ALCAL microcapsule had several advantages compared to more widely used alginate-chitosan-alginate (ACA) microcapsules for the application of cell therapy.     

PROPERTIES OF PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF NEONATAL RAT RETINAL PROGENITOR CELLS IN VITRO

Objective To investigate the properties of proliferation and differentiation of neonatal rat retinal progenitor cells （RPCs） in vitro. Methods RPCs were isolated from neonatal SD rats neural retina and cultured in DMEM/F12 ＋ N2 with EGF and bFGF （suspension medium ） or 10 % FBS without EGF and bFGF （ differentiation medium）. The cells grew as suspended spheres or adherent monolayers, depending on different culture conditions. The neural stem cells or retinal progenitors, neurons, astrocytes, retinal ganglion cells, rod photoreceptors and the proliferating cells were evaluated with immunofluorescence analysis by Nestin or Pax6, Map2, GFAP, Thy-1, Rhodopsin and BrdU antibodies respectively. Results RPCs could propagate and differentiate in suspension or differentiation medium and express the markers of Nestin （92.86%） or Pax6 （86.75%）, Map2 （38.54%）, GFAP （20.93%）, Thy-1 （27. 66%） and Rhodopsin（13. 33%）in suspension medium; however, Nestin （60.27%）, Pax6 （52%）, Map2 （34.94%）, GFAP （38.17%）, Thy-1 （30.84%） and Rhodopsin （34.67%） in differentiation medium. 96.4 % of the population in the neurospheres was BrdU-positive cells. The cells could spontaneously adherent forming some subspheres and retinal specific cell types. Conclusion Neonatal rat RPCs possess the high degree of proliferation and can differentiate into neurons, astrocytes, retinal ganglion cells and rod photoreceptors in vitro. There are different proportions for RPCs to differentiate into specific cell types.     

hGDF5基因转染对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的探讨人生长分化因子5(hGDF5)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用脂质体介导方法将hGDF5基因转入体外培养的兔BMSCs,用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、间接免疫荧光检测hGDF5 mRNA和蛋白质的表达,并通过检测碱性磷酸酶活性、细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖(PG)的表达,分析转染hGDF5对BMSCs增殖、分化的影响。结果hGDF5 mRNA及蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hGDF5基因转染组和对照组相比,ColⅡ、PG表达水平显著增高(P<0.01,P<0.01),而碱性磷酸酶活性和细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hGDF5。高表达的hGDF5可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖和碱性磷酸酶活性无明显影响。     

EMBRYONIC EXPRESSION OF TENASCIN X SUGGESTS A ROLE IN EPICARDIAL AND DUCTUS

ＥＭＢＲＹＯＮＩＣＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＴＥＮＡＳＣＩＮＸＳＵＧＧＥＳＴＳＡＲＯＬＥＩＮ　ＥＰＩＣＡＲＤＩＡＬＡＮＤＤＵＣＴＵＳＡＲＴＥＲＩＯＳＵＳＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＩＮＴＨＥＲＡＴＧｏｎｇＹａｎ；ＧｒａｎｔＨ．Ｂｕｒｃｈ，ＬｉｕＷｅｎｈｕｉ，...     

多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案

目的探讨胚胎干细胞(ESCs)体外定向分化为胰岛祖细胞的分化潜能,应用多步骤诱导逐步筛选法建立高效的胚胎干细胞定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高胚胎干细胞向胰岛祖细胞分化的效率。方法体外传代培养ESCs,采用逐步筛选分化方案,在不同的分化阶段,给予不同的生长因子诱导分化后,RT-PCR法检测胰腺特异性基因的表达,筛选最佳的诱导因子组合,并用免疫细胞化学方法鉴定相关特异蛋白的表达,从而建立体外高效的定向分化方案。结果从未分化ESCs定向分化为定形内胚层细胞,以活化素A诱导组的Sox17和Foxa2基因表达最显著;从定形内胚层细胞分化到后前肠细胞,以维甲酸+FGF10诱导组的Hnf4a和Hnf6基因表达最显著;从后前肠细胞定向分化到胰腺内胚层细胞,以维甲酸+环杷明+DAPT+Exendin 4诱导组的Pdx1、Ptf1a、Hblx9等胰腺特异性基因表达最显著;从胰腺内胚层细胞定向分化到胰岛祖细胞,以维甲酸+DAPT+Exendin 4诱导组的Ngn3、Nkx6.1、Pax4、Pax6等基因表达最显著。免疫细胞化学方法检测可见胰腺特异性的相关蛋白表达,多数Ngn3+细胞同时表达胰腺特异性基因Nkx6.1和Pdx1。结论应用多步骤诱导逐步筛选法可以建立高效的ESCs定向分化为胰岛祖细胞的分化方案,提高ESCs向胰腺内胚层分化的分化效率,为1型糖尿病的β细胞再生治疗提供试验依据和可行性方案。     

ICR－191体外诱发人成纤维细胞恶性转化的初步研究

ＭＳＵ－１．１细胞株是由ｖ－ｍｙｃ癌基因转染正常二倍体人成纤维细胞后所建立的生命期无限的近二倍体细胞株，使该细胞暴露于实验研究用广谱诱变剂ＩＣＲ－１９１以建立体外细胞转化体系，结果表明剂量０．３５及０．４５μｍｏｌ／Ｌ的ＩＣＲ－１９１可使ＭＳＵ－１．１细胞转化成具有转化灶形成能力和成瘤性的恶性转化细胞。本文支持永生化是人类细胞培养的多步骤的恶性转化过程的前提条件的假说。为建立的致癌物诱发细胞转化体系为研究阐明人类多步致癌的分子机理提供了一个有用的模型体系。     

The role of interleukin-8 produced by tumor induced fibroblasts in the development of cutaneous melanoma

Objective To determine the role of interleukin-8 (IL-8) produced by tumor induced fibroblasts in the development of cutaneous melanoma. Methods B16 melanoma cells induced L929 fibroblasts phenotype was transdifferentiated to myofibroblasts (MF) by co-culture in vitro. MF was monitored by morphology and immunophenotype for a-SMA. The level of IL-8 was detected by ELISA. The effect on B16 cell proliferation rate was estimated using MIT method in vitro. Melanoma implanting model was constructed in C57 mice. Results L929 MF phenotype could be modulated by B16 melanoma cells-derived transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and elevated the levels of IL-8. L929 MF did not influence the B16 melanoma cells viability in vitro, but shortened the time of tumor formation and increased the incidence rates of tumors in C57 implanting model mice. Conclusion Fibroblasts can be activated by tumor cells and produce IL-8, which acts as an inflammatory cytokine promoting the development of cutaneous melanoma.     

成纤维母细胞造血支持作用的研究

比较了成纤维母细胞 ( Fibroblast)在成人外周血、骨髓和脐带血的不同情况及成纤维母细胞的造血支持作用。结果显示 :1氢化可的松明显促进成纤维母细胞的生长。 2成人外周血中无成纤维母细胞集落形成单位 ( Colony forming unit-fibroblast,CFU- F)。 3骨髓中 CFU- F的数量多于脐带血 ( P <0 .0 1 )。 4骨髓和脐带血中的 CFU- F促进粒系 -单核系祖细胞 ( Granulocyte macrophage colony- formingunit,CFU- GM)集落形成 ,两者比较无明显差异。表明成纤维母细胞的存在很可能有助于粒单系祖细胞的分化和成熟。     

神经递质P物质通过调控转录因子Osterix的表达促进成骨细胞分化

目的 研究神经递质P物质调控成骨细胞分化的分子途径.方法 分离骨髓基质干细胞进行原代及传代培养;分别采用空白对照、P物质、P物质NK1受体拮抗剂、P物质+P物质NK1受体拮抗剂进行干预,诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化;传代培养1～2周后,抽提细胞总RNA,用RT-PCR检测分化过程中Osterix基因的表达.检测结果重复3次,采用单因素方差分析检测结果.结果 骨髓基质干细胞在生长对数增殖期为4～6 d,采用RT-PCR检测发现P物质干预成骨细胞分化,导致成骨细胞分化过程中重要的转录引子Osterix 基因表达,与其他各组比较有显著差异(P<0.05),Osterix基因表达上调,从而刺激前成骨细胞向成骨细胞转化.而P物质+P物质NK1受体拮抗剂共同干预,Osterix基因表达与空白对照组无显著差异(P<0.05),说明P物质通过P物质NK1受体对成骨细胞分化进行调控.结论 P物质可调控前成骨细胞分化过程中转录因子Osterix基因表达促进其向成骨细胞分化.P物质对Osterix基因表达的调控依赖P物质NK1受体.