NT4-ADNF-9融合基因原核表达载体的构建

目的　构建神经营养素 (NT4 )与活性依赖性神经营养因子 9(ADNF 9)融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9,为进一步对神经系统退行性疾病基因治疗的研究奠定基础。方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的ADNF 9的cDNA ,将其连接到NT的信号肽和前导序列的 3′端 ,组成融合基因NT4 ADNF 9,再将该融合基因亚克隆于原核表达载体pBV2 2 0 ,构建为pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。结果　经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将ADNF 9重组到NT4信号肽和前导序列的 3′端 ,并将融合基因亚克隆于pBV2 2 0内。结论　成功构建了NT4与ADNF 9融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。     

融合基因Aβ-HBcAg的原核表达及表达蛋白的免疫反应性和免疫原性分析

目的　研究 β 淀粉样肽 (β amyloidpeptide,Aβ)与乙型肝炎核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,检测融合蛋白的免疫反应性及免疫原性。方法　将重组质粒pBV2 2 0 /Aβ HBcAg转化大肠杆菌DH5α,温控表达 ,超声破碎细菌 ,通过SDS PAGE、考马斯亮蓝染色和ELISA等方法 ,观察Aβ HBcAg的表达及融合蛋白的免疫反应性 ;用融合蛋白免疫Balb/c小鼠 ,ELISA法检测血清中的抗 Aβ抗体和抗 HBc抗体滴度。结果　融合蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中 ,表达量为菌体沉淀的 5 % ,融合蛋白既有Aβ的免疫反应性 ,又有HBcAg的免疫反应性。Balb/c小鼠经过 3次免疫后 ,血清中的抗体滴度很低 ,继续强化免疫 2次后 ,血清中抗 Aβ抗体滴度、抗 HBc抗体滴度分别上升为 1∶80 0和1∶32 0 0。结论　融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达 ,表达蛋白有一定的免疫反应性和免疫原性 ,但表达量较低 ,免疫反应性和免疫原性较弱。提示融合基因Aβ HBcAg的表达量和融合蛋白免疫原性的提高尚需进一步研究。     

β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备

目的　制备稳定分泌β -淀粉样肽 1～ 4 2 (Aβ1-42 )单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,产生高效价抗体。方法　通过基因工程技术 ,将Aβ1-42 基因融合于乙肝核心抗原 (HBcAg)的主要免疫优势区 (MIR) ,制备Aβ和HBcAg的融合蛋白 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0细胞融合 ,筛选能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果　得到两株能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,Aβ1-42 单克隆抗体的Ig亚类为IgG3 。结论　制备得到的Aβ1-42 单克隆抗体特异性强 ,效价高     

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

先天性长QT综合征相关人类HERG基因真核表达载体的构建及其功能表达

目的构建先天性长QT综合征相关HERG基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,建立稳定的细胞系,探讨基因的功能。方法原核克隆载体pGEM-HERG经限制性内切酶获得HERG cDNA,将HERG cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3中,用Lipofectamin2000转染试剂介导将pcDNA3-HERG及荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至HEK-293细胞,利用G-418进行细胞筛选,并用稀释法建立稳定的HEK-HERG细胞系。用全细胞膜片钳技术检测HERG基因的功能表达情况。结果在原核克隆载体pGEM-HERG的基础上构建了HERG的真核表达载体pcDNA3-HERG,并使其在HEK-293细胞中成功表达,建立的HEK-HERG细胞系稳定传代。膜片钳技术检测到了HERG通道电流的表达。结论该方法可成功构建及表达HERG的真核表达载体,为今后突变型HERG的研究奠定了基础。     

TAT-BACEsp-GFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础.方法 利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TAT-BACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TAT-BACEsp产物与设计的完全吻合;TAT-BACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点.结论 成功构建了TAT-BACEsp与GFP 融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体.     

NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组载体的构建

目的设计构建携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的cDNA融合基因的重组载体,为针对Survivin的靶向治疗奠定基础。方法应用非对称引物/模板法、PCR技术制备NT4-Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片断,连接于pGEM-T-Easy载体,经克隆测序、酶切后与PBV220/NT4质粒连接;转化感受态细胞E.coliDH5α,亚克隆获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因。结果克隆出Ant-Shepherdin[79-87]基因,经酶切及测序证实结果正确;连接PBV220/NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因片断。结论通过分子生物学技术成功构建了携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。     

人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

目的获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基--βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达。结果通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达。结论IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白。     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达

目的克隆Graves’病患者甲状腺组织T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8目的基因,重组为CTLA-4-TCRVβ8基因并表达出融合蛋白。方法RT-PCR从Graves病患者甲状腺组织中克隆T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8基因,依次与表达质粒进行连接,双酶切及测序鉴定获得正确的重组子;原核表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western-Blotting检测蛋白表达情况。结果基因克隆扩增出CTLA-4和TCRVβ8目的基因片段,测序结果证实序列与已发表的一致。重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的蛋白。结论成功构建和表达了CT-LA-4-TCRVβ8基因,为探索Graves’病免疫耐受治疗提供了基因产品。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得366bp的核心蛋白基因片段。将其插入连接载体pMD18-T vector中,酶切后再与表达载体pBV220连接,构建重组表达载体pBV220/HCV-C。经鉴定后温度诱导表达,采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测核心蛋白基因的蛋白表达。结果经温度诱导后获得目的基因的非融合表达,SDS-PAGE电泳显示在14000 u处有一表达条带;Western-blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论丙型肝炎病毒核心蛋白基因成功表达,对临床诊断试剂和HCV基因疫苗的研制有一定的意义。     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　将具有全长血小板生成素 (TPO)活性的N端截短血小板生成素cDNA(T1 84)作为目的基因 ,在中华仓鼠卵巢细胞 (CHO)中成功表达。方法　将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶 (DHFR)为筛选扩增基因的 pDC B真核表达载体 ,通过不断提高MTX浓度 ,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果　构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒 ,并能在CHO细胞中高效表达。结论　N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达 ,其产物具有全长TPO的活性。     

牙龈卟啉菌蛋白酶rgp Acd基因表达载体的构建

目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b/rgpAcd,通过限制性酶切鉴定。结果PCR产物电泳结果显示,在大约1.5 kb处有一特异的条带,与预期的大小一致,核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性,未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致,表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。     

饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达

目的　通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法　应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段 ,并克隆到pUC1 9载体中 ,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列 ,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX 4T 1表达载体中 ,经BamHI和EcoRI双酶切后 1 2 %凝胶电泳鉴定 ,IPTG诱导表达产物经SDS PAGE分析。结果　克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF1 3830 0记载的序列完全一致 ,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65 6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论　本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST Decorin融合蛋白     

人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定

目的　在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性。方法　将 NGFβ目的基因亚克隆入表达载体pBV220的BamHI- BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达产物复性,将复性后的蛋白质加入体外培养的鸡胚背根神经节及 PC12 细胞BrdU掺入实验,观察表达蛋白的生物学活性。结果　成功构建了重组质粒 pBV220/NGFβ。使用该质粒转化 DH5α宿主菌,使用热诱导方法表达了NGFβ蛋白,SDS PAGE结果提示表达蛋白主要存在于包涵体中。通过肝素亲和层析可以获得纯度大于90%的 NGFβ。每升表达菌可以获得 1.8~2.0 mg NGFβ。鸡胚背根神经节突起生长实验和PC12细胞培养生长刺激BrdU掺入实验表明原核表达的 NGFβ是具有生物活性的。它的生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×105 BU/g。结论　在大肠杆菌中可以表达出有活性的NGFβ蛋白。     

含人谷胱苷肽过氧化物酶基因重组腺病毒的构建

目的构建含人谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)基因的重组腺病毒载体,为基因治疗提供一种新的方法。方法从人血中分离出白细胞,提取总RNA,采用RT-PCR法获得人GPx-1和人GPx-2的全长cDNA,克隆到pcD-NA3.1+中,构建pcDNA3.1+GPx-1和pcDNA3.1+GPx-2载体,酶切和基因测序鉴定阳性克隆;采用酶切法把GPx-1和GPx-2基因克隆至入门载体pENTR1A中,构建pENTR1A-GPx-1和pENTR1A-GPx-2载体。采用LR反应,体外重组pENTR1A-GPx-1或pENTR1A-GPx-2和pAd/CMV/V5-DEST,得重组腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST-GPx-1和pAd/CMV/V5-DEST-GPx-2。PCR和序列测定鉴定重组腺病毒载体。293A细胞中包装和扩增GSH-Px-1和GSH-Px-2的重组腺病毒。结果获得GSH-Px-1和GSH-Px-2的重组腺病毒载体和重组腺病毒。结论成功构建了pAd/CMV/V5-DEST-GPx-1和pAd/CMV/V5-DEST-GPx-2重组腺病毒载体,并在293A中获得该重组腺病毒,为进一步研究人GSH-Px基因在基因治疗中的作用奠定了基础。