人B7.2 cDNA的克隆及其真核表达

为克隆人 B7.2 c DNA,构建 B7.2真核表达质粒 ,并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞 ,经 LPS诱导后 ,以 RT- PCR,克隆 B7.2 c DNA;构建真核表达质粒 p BCMGSNeo- B7.2 ,转染哺乳细胞 ,进行表达。结果成功克隆了 B7.2c DNA,并经测序证实 :所构建的 B7.2抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经 LPS诱导的人淋巴细胞可表达 B7.2 m RNA,所建立的 p BCMGSNeo-B7.2哺乳动物真核表达质粒 ,可供进一步研究 B7.2结构和功能。     

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。     

葎草花粉cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建葎草花粉cDNA表达文库,为进一步筛选葎草花粉的主要致敏蛋白组分、制备重组变应原奠定基础。方法采集新鲜葎草花粉,过筛后液氮保存,利用Trizol法抽提葎草花粉总RNA,纯化后PCR法反转录合成cDNA。经SfiⅠ酶切,过凝胶柱层析,去除小于400 bp的片断,收集大于400 bp的cDNA片段,加工后与λTripIEx2连接,文库体外包装,取出一小部分感染宿主菌XL1-Blue MRF,检测文库容量;PCR分析插入的cDNA片段的大小及多样性。结果成功构建一个含有5×105重组子的葎草花粉表达文库,重组率为90%,平均插入片段长度约为1.02 kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选克隆的目的cDNA。     

人UCA1基因新剪接变异体全长cDNA序列的克隆

目的克隆新的UCA1剪接变异体全长cDNA序列,为研究其可变剪接机制奠定基础。方法用电子克隆技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增细胞系BLZ-211cDNA并进行产物测序和序列拼接。结果新克隆的UCA1剪接变异体全长cDNA序列为2 202bp。结论综合采用电子克隆技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法,为该基因的后续可变剪接机制的研究奠定了基础。     

西安市过敏性哮喘变应原谱的分析

目的调查西安市过敏性哮喘的常见变应原,为本地区变态反应性疾病的防治提供依据。方法采用14种吸入和7种食入常见变应原的标准提取液对2005年1月～2011年6月就诊我科的857例过敏性哮喘患者进行皮肤点刺试验,并比较不同性别和不同年龄段变应原阳性率的差异。结果吸入变应原阳性率依次为粉尘螨、屋尘螨、艾蒿、法桐、霉菌、藜草、葎草、禾本科等,食入组变应原以虾、螃蟹、牛奶、鸡蛋为主;不同性别变应原阳性情况无显著差异,仅有杨树不同(P<0.05);<20岁人群变应原阳性率较高,尤其是粉尘螨、多价羽毛与其余年龄段阳性率差异较大(P<0.05)。结论粉尘螨、屋尘螨、艾蒿、法桐、霉菌、藜草、葎草等为西安市最主要的变应原,不同性别之间变应原无显著差异;不同年龄段之间青少年变应原阳性率较高。     

Screening of hepatocyte proteins binding to NS5ABP37 protein by yeast-two hybrid system

Objective To investigate the biological function of NS5ABP37 and to look for proteins interacting with NS5ABP37 protein in hepatocytes. Methods We constructed bait plasmid expressing NS5ABP37 protein of hepatitis C virus (HCV) by cloning the gene of NS5ABP37 protein into pGBKT7, then the recombinant plasmid DNA was transformed into yeast AH109 (α type). The transformed yeast AH109 was mated with yeast Y187 (α type) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing of plasmids from positive (blue) colonies, we made a sequence analysis by bioinformatics. Results We screened twenty-five proteins binding to NS5ABP37, including Homo sapiens cyclin Ⅰ (CCNI) gene, Homo sapiens matrix metallopeptidase 25 (MMP25) and Homo sapiens talin 1. Conclusion The yeast-two hybrid system is an effective method for identifying hepatocyte proteins interacting with NS5ABP37 of HCV. And the biological function of NS5ABP37 may be associated with glycometabolism, lipid metabolism and apoptosis.     

K562细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的　构建K5 6 2细胞表达型cDNA文库。方法　提取K5 6 2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5’端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的λgt11噬菌体连接 ,体外包装后建成cDNA文库。取出 1μL倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果　构建成含 1.0 2× 10 6重组子的K5 6 2细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.3kb。结论　所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆。     

HPV16L1与共刺激分子B7-2裸DNA共免疫小鼠后细胞免疫反应原位观察

目的　原位研究PRC/CMVL1与B7 2裸DNA经肌肉免疫小鼠后的细胞免疫反应 ,尤其是细胞毒性T细胞(CTL)反应。方法　①取雌性C5 7BL/ 6小鼠 15只 ,随机分为 3组 :PRC/CMVL1质粒免疫组、PRC/CMVL1质粒和PLXHD .mB7 2质粒共免疫组 ;同时设空质粒对照 ,经小鼠股四头肌肌内注射 ,共免疫 3次 ,每次间隔 3周。②免疫 9周后取脾脏 ,中性福尔马林固定、石蜡包埋 ,常规切片 ,以地高辛标记的IFN γ及Perforin寡核苷酸为探针 ,原位杂交技术检测试验小鼠脾脏的IFN γ及Perforin阳性细胞。结果　PRC/CMVL1质粒免疫组可见脾脏增大 ,淋巴小结增多 ,T细胞区及淋巴滤泡明显活化 ;与PLXHD .mB7 2质粒共免疫组变化更为明显 ;PLXHD .mB7 2质粒共免疫组IFN γ和Perforin阳性细胞较PRC/CMVL1单独免疫组为多。结论　PRC/CMVL1裸DNA疫苗免疫可诱发明显的细胞免疫反应 ,PLXHD .mB7 2质粒共免疫可提高细胞免疫水平。     

法国梧桐花粉的部分纯化及其主要变应原免疫活性分析

目的　对法国梧桐花粉变应原进行部分纯化并对其主要变应原免疫活性进行分析。方法　采用凝胶层析法分离纯化法国梧桐花粉变应原 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的主要峰段的蛋白质分子质量 ,并对 7例法国梧桐花粉过敏支气管哮喘患者血清进行免疫印迹分析。结果　法国梧桐花粉变应原粗制液经SephadexG 10 0层析柱洗脱得两个洗脱峰 ,第一峰及第二峰升段富含蛋白 ;收集各段进行SDS PAGE电泳 ,第一峰升段、峰段、降段电泳图相似 ,主要含分子质量为 2 2～ 71ku之蛋白质 ,第二峰升段以分子质量为 14～ 16ku之蛋白质为主。电泳结果清晰显示 6条蛋白区带 ,分子质量分别为 71、5 0、35、39、2 2、16ku。免疫印迹分析可见 4条sIgG反应带 ,分子质量为 5 0、39、2 2、16ku。结论　法国梧桐花粉变应原含 6种主要蛋白成分 ,第一峰蛋白质含量高 ,为主要致敏组分 ;第二峰蛋白质含量少 ,为次要致敏组分。