Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达

目的　构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法　采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础上构建真核表达载体pcDNA/anti CD3scFv B7.1,并经脂质体法转染COS 7细胞 ,免疫组织化学法检测表达。结果　获得了序列与预期完全相同的融合基因 ;构建了抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ;在COS 7细胞中获得初步表达。结论　成功构建及表达抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ,为进一步研究抗CD3scFv B7.1双功能分子的生物学活性及用于肿瘤生物治疗奠定了基础     

人促甲状腺素受体膜外区基因克隆及真核表达

目的 克隆人促甲状腺激素受体胞外段基因,构建重组真核表达质粒,获得具有免疫学活性的纯化重组蛋白.方法 应用RT-PCR技术从人甲状腺组织得到TSHR膜外区cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO细胞,RT-PCR鉴定基因转录,用免疫细胞化学染色法和Western Blot鉴定表达蛋白.结果经测序证实筛选得到的重组体中存在序列正确的TSHR膜外区基因,表达蛋白具有免疫活性.结论成功克隆了人促甲状腺素受体膜外区基因和构建了真核表达载体,并将其在真核细胞中成功表达.     

人PIF1及其截短体重组蛋白的真核表达及其细胞内定位

目的构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)截短体真核表达重组质粒,进行真核表达,并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位。方法以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag 2B质粒中构建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒;通过lipofectamine2000将重组质粒转染人293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达,用免疫荧光法检测其细胞内定位。结果成功构建了PIF1及其截短体真核表达重组体,并在真核细胞内成功表达。确定PIF1定位于核内,PIF1C定位于整个细胞,呈弥散分布,PIF1N主要定位于核内。结论在真核细胞中成功表达了PIF1、PIF1C、PIF1N,且发现PIF1N对PIF1的入核起重要作用,为进一步研究其PIF1及其各结构域奠定了实验基础。     

人B7.2 cDNA的克隆及其真核表达

为克隆人 B7.2 c DNA,构建 B7.2真核表达质粒 ,并在哺乳动物细胞中表达。分离正常人淋巴结淋巴细胞 ,经 LPS诱导后 ,以 RT- PCR,克隆 B7.2 c DNA;构建真核表达质粒 p BCMGSNeo- B7.2 ,转染哺乳细胞 ,进行表达。结果成功克隆了 B7.2c DNA,并经测序证实 :所构建的 B7.2抗原真核表达质粒可在哺乳动物细胞中高效表达。表明经 LPS诱导的人淋巴细胞可表达 B7.2 m RNA,所建立的 p BCMGSNeo-B7.2哺乳动物真核表达质粒 ,可供进一步研究 B7.2结构和功能。     

重组小鼠血管抑素基因在胆囊癌细胞中的表达及对血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的　研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞能否表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白。方法　应用脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转染胆囊癌细胞株GBC SD ,G4 18抗性筛选 ;以Westernblot检测血管抑素的表达 ,以血管内皮细胞增殖分析检测其活性。结果　经Westernblot检测 ,得到高表达血管抑素的胆囊癌细胞克隆 ,其培养上清能有效抑制bFGF刺激的血管内皮细胞增殖 (P <0 .0 5 )。结论　小鼠血管抑素基因真核表达质粒 pcDNA3.1(+) angiostatin转导的胆囊癌细胞能够表达具有生物学活性的血管抑素蛋白 ,在胆囊癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值     

脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.     

SLC-Her-2/neu-p53-Fc融合基因重组腺病毒真核表达载体对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果

目的扩增纯化携带融合基因SLC-Her-2/neu-p53-Fc(SLC-HP-Fc)的重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体,研究其对荷黑色素瘤小鼠的免疫治疗效果。方法将重组腺病毒真核表达载体AdEasyTM-SLC-HP-Fc在人胚肾293细胞中扩增、纯化;向小鼠皮下注射表达Her-2/neu-p53融合基因的B16F10-psig-Her-2/neu-p53细胞(B16-HP细胞)建立荷黑色素瘤小鼠模型;将小鼠随机分成对照组、肌肉注射组和皮下注射组,用重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体进行治疗,观察肿瘤生长情况,测定细胞毒性活性、血清p53抗体。结果纯化后重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体滴度8×108pfu/mL。目的基因SLC-HP在小鼠体内成功表达。重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能有效抑制小鼠肿瘤的生长,瘤重与对照组比较差异有统计学意义(P=0.005),抑瘤率达到98.8%,细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的特异性杀伤力有明显提高。结论重组腺病毒AdEasyTM-SLC-HP-Fc真核表达载体高剂量肌肉注射能延长出瘤时间,抑制肿瘤的生长。     

survivin-siRNA质粒的构建及其抑制survivin基因在Hela细胞中的表达

目的 合成、克隆、筛选survivin-siRNA干扰片段,构建含有survivin-siRNA的骨架质粒,明确其抑制survivin基因在Hela细胞中表达.方法 利用RNA干扰方法构建真核表达载体pGenesill.1-survivin-siRNA.体外培养人宫颈癌Hela细胞,利用脂质体法将该质粒转染Hela细胞.利用Western blot法检测该质粒转染后survivin基因的表达,筛选最佳干扰质粒.通过MTT法检测Hela细胞的生长.通过流式细胞学技术检测细胞凋亡率.结果 成功构建及筛选出survivin-siRNA质粒.MTT实验及流式细胞学实验'证实该质粒体外能够有效诱导细胞凋亡.结论 成功构建survivin-siRNA质粒,为今后应用该质粒进行宫颈癌的基冈治疗提供了实验基础.     

表达HCV core-Ant的重组慢病毒的构建

目的 构建表达HCV 核心区的重组慢病毒,以探讨HCV感染后该病毒核心蛋白对肝脏干细胞转分化的影响.方法 利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得HCV core-Ant基因克隆,酶切后连入pLenti6/V5-D-TOPO质粒,得到pLenti6/V5-D-HCV core-Ant,连同pLP/VSVG、pLP1和pLP2四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCV core-Ant重组慢病毒.收集病毒上清,大量扩增,用免疫组化法检测目的 基因在Hela细胞的表达.用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒并测定其滴度.结果 克隆出HCV core-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;使用表达HCV core-Ant重组慢病毒感染Hela细胞,免疫组化实验证实胞浆有HCV core表达.使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光,说明构建慢病毒载体有效.结论 通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCV core的重组慢病毒,为进一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础.     

肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体的构建

目的 构建肿瘤特异性Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体.方法 PCR扩增Survivin启动子,构建重组载体pGEMT/pSurv并酶切、测序鉴定.体外化学合成编码FAK shRNA寡核苷酸链并退火互补成双链,构建真核表达载体pGenesil-FAK shRNA并酶切、测序鉴定.用Survivin启动子替换pGenesil-FAK shRNA中的U6启动子,重组为Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体pGenesil-pSurv-FAK shRNA.将pGenesil-pSurvFAK shRNA转染至肝癌细胞系HepG2,观察转染效率.48h后应用RT-PCR法检测转染重组质粒后HepG2细胞中FAK mRNA的表达变化.结果 成功构建了肿瘤特异性Survivin启动子驱动的真核表达载体pGenesil-pSur-FAKshRNA,转染至肝癌细胞HepG2后可明显下调HepG2细胞中FAK mRNA表达水平.结论 以Survivin启动子驱动的FAK shRNA真核表达载体能够有效下调肝癌细胞FAK的表达,为进一步以靶向干扰FAK表达为主要手段的肝癌联合治疗提供实验依据.     

增强型绿色荧光蛋白标记的Hela细胞株的建立

目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。     

Influence of baicalin on the expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand and osteoprotegerin in human periodontal ligament cells

Objective To study the effect of baicalin on the expression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) in cultured human periodontal ligament (HPDL) cells. Methods Small interfering RNA (siRNA) eukaryotic expression vector targeted transforming growth factor βⅡ receptor (TGF-β RⅡ) was constructed and transfected into T cells. HPDL cells with T cells transfected with siRNA or not were placed in the culture medium that had been added with lipopolysaccharide (LPS) and baicalin. The obtained solution was divided into six groups according to the components (group Ⅰ: HPDL cells+LPS+T cells transfected with siRNA1+baicalin;group Ⅱ: HPDL cells+LPS+T cells transfected with siRNA1; group Ⅲ: HPDL cells+LPS+T cells+baicalin; group Ⅳ: HPDL cells+LPS+T cells; group Ⅴ: HPDL cells+baicalin; group Ⅵ: HPDL cells) and was cultured for 48 hours. RT-PCR was used to observe the effect of baicalin on the expression of OPG-RANKL in HPDL cells. Results The ratio of RANKL/OPG in group Ⅰ was lower than that in group Ⅱ (P<0.01) and higher than that in group Ⅲ (P<0.01); The ratio of RANKL/OPG in gronp Ⅲ was lower than that in group Ⅳ (P<0.01); the ratio of RANKL/ OPG in group Ⅳ was higher than that in group Ⅵ (P<0.01); the ratio of RANKL/OPG in group Ⅴ was lower than TGF-β signaling transduction plays an important role in the effect of baicalin on the RANKL/OPG ratio in HPDL cells.     

丝裂霉素C与表达Smac/DIABLO的肿瘤靶向腺相关病毒联用对抗恶性黑色素瘤的效果

目的探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导促凋亡因子Smac/DIABLO是否能提高恶性黑色素瘤细胞对丝裂霉素(MMC)的敏感性。方法将携有目的基因的rAAV加入到培养液中转染肿瘤细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,RT-PCR检测Smac/DIABLO基因的表达,MTT法测定肿瘤细胞增殖,流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡;动物在体实验测定抗肿瘤效果。结果 rAAV转染96h后几乎所有细胞表达明亮的黄绿色荧光。RT-PCR检测发现转染48h后目的基因Smac/DIABLO稳定表达。MTT检测显示rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC对肿瘤细胞的抑制率最高(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC组肿瘤细胞的凋亡率明显高于生理盐水(HBSS)组、MMC组和rAAV-hTERT/Smac/DIABLO组(P<0.01)。动物实验结果表明,rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC有非常强的抑制肿瘤作用,其抗癌效果优于HBSS、MMC、rAAV-hTERT/EGFP和rAAV-hTERT/Smac/DIABL组。结论 rAAV-hTERT/Smac/DIABLO在体内、体外均能提高肿瘤细胞对MMC的敏感性。此作用与Smac/DIABLO的促凋亡作用有关。     

Eukaryotic expression and biological activity analysis of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin

Objective To investigate the expression of neuroprotective peptide [Gly14]-Humanin (HNG) in eukaryotic cells by gene engineering technique and analyze its biological activity. Methods By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of HNG with FLAG in its C-terminal was obtained, which was cloned into the plasmid pcDNA3.1(-), and the resultant recombinant vector pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was transfected into PC12 cells. At the same time, the recombinant vector pcDNA3.1(-)/EGFP was transfected to control the efficiency of transfection. The expression of HNG in the cells was determined by immunocytochemistry. In order to analyze the biological activity of the expressed HNG, 25μM Aβ25-35 peptide was added to the culture medium of the transfected cells for 24h, then cell morphology, MTT assay and Hoechst 33258 staining were observed. Results The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG was identified by enzyme digestion and sequencing. HNG was highly expressed in PC12 cells. After exposure of PC12 cells to 25μM Aβ25-35 for 24h, cell viability decreased to (65.8±5.3)%, and the dystrophic changes of neuritis and nuclei condensation were obvious. When cells were pre-transfected with pcDNA3.1(-)/HNG-FLAG, Aβ25-35-induced cell death and morphological changes of cells and nuclei were suppressed. In contrast, pre-transfected with empty vector did not protect cells from Aβ25-35-induced toxicity. Conclusion The eukaryotic expression vector for FLAG-tagged HNG was successfully constructed and expressed in PC12 cells. Expressed HNG has biological activity.     

IN VITRO CO-STIMULATORY ACTIVITY OF HUMAN B7.2(IgV+C)PROTEIN PRODUCED BY ENGINEERED BACTERIA

It was well known that "two signals" wereboth necessary to activate T lymphocytes. The firstsignal was provided by TCR--CD, which was en-gaged with antigen peptide--MHC complex, and thesecond, also named the costimulatory signal, wasprovided by the interaction between costimulatorymolecules B7. l and B7. 2 on antigen presenting celland its counter--receptor CD28/CTLA4 on T cell.The first signal alone without costimulation willlead T cell to anergy or apoptosis['~'2. B7. 2 mayplay a cri…     

共刺激分子B_(7.1)拼接异构体的初步研究

利用B1.7cDNA特异性引物、RT-PCR技术从新鲜淋巴瘤组织中扩增得到一与标准型B7.1片段长度不同的B7.1分子。进一步将该片段插入真核表达载体PSVL中，转染细胞得到了较高水平的表达。免疫组化研究结果证实抗B7.1单抗可与该片段编码的蛋白结合，提示该cDNA片段为B7.1抗原的拼接异构体。     

基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因C1反式调节基因

目的对未知功能基因C1转染人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)后的基因表达谱进行分析,探索该基因的表达对肝细胞基因表达谱的影响及其可能的调节功能线索。方法以分子生物学技术构建C1的真核表达载体pcDNA3.1(-)-C1,以表达质粒pcDNA3.1(-)-C1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA,逆转录为cDNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果HepG2细胞经转染C1表达质粒后,有26条差异表达基因,其中24条基因表达水平下调,2条基因表达水平上调。这些差异表达的基因与细胞信号转导、凋亡、细胞增生分化及肿瘤的发生密切相关。结论应用基因表达谱芯片成功筛选了C1转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明C1蛋白可能的生物学功能及乙型肝炎病毒核心蛋白的致病机制提供了理论依据。     

人B7.2(CD86)胞外区原核表达及其工程菌发酵培养的实验研究

目的　利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)并对工程菌发酵培养条件进行优化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术从B7.2cDNA全长中克隆B7.2 (IgV +C) ,将PCR产物克隆入表达载体 pGEX 4T 3从而得到重组体 pGEX 4T 3 /hB7.2 (IgV +C) ,SDS PAGE及Westernblot用于检测目的蛋白的表达 ,同时对目的蛋白诱导表达时间及诱导剂浓度进行优化 ,对重组质粒的遗传稳定性进行鉴定。结果　Westernblot结果显示相应分子质量 5 5kD处有hB7.2 (IgV+C)与GST融合蛋白的高效表达 ,表达量占菌体总蛋白的 3 0 %左右。对工程菌进行发酵培养研究的结果表明 ,所构建的重组质粒在工程菌DH5α中传代稳定 ,未见质粒丢失 ,目的蛋白的表达不受影响 ,且在 3 7℃诱导 5h、IPTG终浓度为 4mmol·L- 1 时其表达量最多。结论　证明了利用原核系统表达人B7.2 (IgV +C)的可行性。