大鼠骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化中碱性磷酸酶的变化

目的　研究大鼠骨髓间充质干细胞药物诱导定向成骨细胞分化特性及分化过程中碱性磷酸酶的变化。方法　用质量浓度为 1.0 73kg·L-1的Percoll分离骨髓间充质干细胞 ,再连续进行 3次换液以纯化骨髓间充质干细胞。加药物 β 甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C诱导骨髓间充质干细胞定向成骨细胞分化。在加药后 5、10、15、2 0d用比色法检测细胞中碱性磷酸酶含量。改良Gomori染色 ,统计阳性细胞百分率。结果　梯度密度离心和黏附贴壁法联合使用可得到均一的骨髓间充质干细胞。用比色法测得在第 5、10、15、2 0d ,碱性磷酸酶含量 (A40 5)分别为 0 .391± 0 .0 2 14、0 .4 345± 0 .0 2 31、0 .8781± 0 .0 2 96和 0 .933± 0 .0 2 36 ;对照组为 0 .16 5 6± 0 .0 2 4 2、0 .15 2 8± 0 .0 2 15、0 .14 5 3± 0 .0 2 0 4和 0 .14 35± 0 .0 2 16。同时期改良Gomori染色阳性细胞率分别为 10 .35 %、11.4 8%、35 .2 8%和 4 6 .7%。结论　大鼠骨髓间充质干细胞经药物诱导后可以分化成成骨细胞。在分化过程中碱性磷酸酶含量从给药后的 10d左右才开始显著升高。在此过程中改良Gomori染色结果与其保持一致     

低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

目的利用低强度间断负压诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞定向分化。方法分离人骨髓,利用梯度离心法进行MSCs的培养,取第三代细胞利用低强度间断负压诱导分化;倒置显微镜下观察细胞的形态,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,茜素红染色观察钙结节形成,免疫组织化学检测Ⅰ型胶原和骨保护素的表达。结果低强度间断负压诱导2周后,细胞呈现出成骨细胞形态,ALP活性明显增强,茜素红染色可见钙结节形成,Ⅰ型胶原和骨保护素表达阳性。结论利用低强度间断负压可以成功的诱导MSCs向成骨细胞定向分化,诱导的细胞具有典型的成骨细胞特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察

目的　分离和培养大鼠骨髓组织中的间充质干细胞 ,并观察其生长形态。方法　利用造血干细胞和骨髓间充质干细胞不同生长特性 ,采用贴壁法分离并用含 15 % (体积分数 )FBS的低糖型DMEM培养基培养。结果　分离培养得到的细胞中随着换液次数的增加红细胞和造血细胞逐渐减少 ;骨髓组织中贴壁得到间充质干细胞呈梭形、纺锤形和多角形。结论　贴壁法可以分离培养骨髓中的间充质干细胞     

大鼠来源脂肪干细胞的分离培养及其分化能力的检测

目的分离、培养及鉴定SD大鼠来源脂肪干细胞,为后续实验选取合适的种子细胞奠定基础。方法切取SD大鼠腹股沟处皮下脂肪,利用酶原消化合并差速贴壁的方法获得细胞,在倒置相差显微镜下观察细胞形态和增殖特征,测定其生长曲线,进行冻存复苏实验。第3代细胞在成骨诱导液作用下向成骨方向分化,进行Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色;使用成脂诱导液诱导其向成脂方向分化,进行油红O染色。结果从大鼠脂肪组织获得的细胞,呈成纤维细胞样生长;经成骨诱导液培养后,表现出成骨细胞特性,Ⅰ型胶原染色、碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;经成脂诱导液培养后,表现出脂肪细胞特性,油红O染色后,胞浆内可见脂肪滴。脂肪干细胞在液氮中冻存2个月复苏后,其生长增殖活性和多向分化能力没有明显降低。结论成功分离和培养大鼠脂肪干细胞,获得的细胞增殖旺盛,具有多向分化潜能,为后期运用组织工程技术修复组织损伤,提供了坚实的基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及体外诱导实验

目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,进行骨向分化诱导,并将诱导的成骨细胞复合钛网体外成骨,为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。用扫描电镜观察骨向诱导后细胞复合钛网的情况。结果用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。扫描电镜可观察到骨向诱导后细胞复合在钛网表面有矿化的基质沉积。结论成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,MSCs能够向成骨细胞分化,骨向诱导后细胞复合钛网体外有矿化的基质。     

麝香酮含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、分化的影响

目的研究麝香酮含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖及其向成骨细胞分化的影响,初步了解麝香酮单体对骨髓间充质干细胞的作用机制。方法贴壁筛选法提取大鼠BMSCs,培养至第3代,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨成脂诱导,鉴定认为培养成功后,利用制备的不同浓度麝香酮含药血清干预。测定细胞增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量等,研究麝香酮含药血清对大鼠干细胞增殖、分化的影响。结果筛选纯化的BMSCs呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主;表型鉴定:CD45阴性,CD44、CD95均呈阳性表达;用含药血清干预后的增殖率、ALP活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量、钙化结节量均高于空白对照组。结论麝香酮含药血清可以促进BMSCs的增殖、成骨分化。     

人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究

目的 探讨并优化人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定;诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,为其进一步应用奠定基础.方法 用酶消化法分离培养hUCMSCs,通过传代培养、扩增,倒置光学显微镜及原子力显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞增殖曲线,流式细胞仪检测免疫表型;体外向成骨、脂肪方向诱导分化,并通过特异性染色鉴定其分化能力.结果 采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs.接种24h,贴壁细胞形态多为长梭型、多边形或成纤维细胞样形态,大小均一.P3、P7代细胞的生长曲线基本一致,增殖能力强.流式细胞仪分析,第3代细胞强烈表达CD29、CD44、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR.经成骨诱导分化后4周,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节;经成脂诱导3周,油红O染色呈阳性,有明显的脂滴出现.结论 本实验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法.所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学形状稳定,并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,有望成为组织工程较为理想的种子细胞.     

小鼠肌源性干细胞的分离、培养及其分化能力检测

目的探讨小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的原代培养方法及其分化潜能,为肌性泌尿组织的细胞修复、治疗奠定基础。方法运用中性蛋白酶(DispaseⅡ)、胰蛋白酶及Ⅰ型胶原酶联合消化法分离小鼠MDSCs,并运用差速贴壁法进行纯化。倒置显微镜下观察细胞形态,RT-PCR法鉴定MyoD及Desmin的表达,同时对分离的细胞进行成骨、成脂等分化诱导并鉴定。结果运用中性蛋白酶可很好地消化组织,差速贴壁法能得到纯度较高的MDSCs;RT-PCR检测发现MDSCs不表达MyoD以及Desmin,提示其为不同于肌卫星细胞的肌源性干细胞;成骨诱导检测碱性磷酸酶(ALP)染色(+),成脂诱导油红O染色(+);其可自体分化诱导为心肌样细胞,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白(cTnI)呈现阳性结果。结论利用此分离方法可获得纯度较高且具有较强分化潜能的肌源性干细胞,有助于进一步进行组织工程研究。     

TGF-β1对成人骨髓CD105~+间充质干细胞增殖与分化的影响

目的分离并鉴定成人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),研究TGFβ1对骨髓MSCs增殖与分化的影响。方法分离成人骨髓单个核细胞;MACS磁珠分选CD105+细胞;FACS检测其免疫表型;诱导分选的CD105+细胞向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色、VonKossa染色及RTPCR检测脂肪细胞及成骨细胞;观察TGFβ1对分选出的CD105+细胞分化与增殖的影响;免疫荧光染色检测诱导后的脂肪细胞CD105的表达情况;MTT法检测TGFβ1对CD105+细胞增殖的影响。结果成人骨髓来源的CD105+细胞体外可向脂肪及成骨细胞分化;在向脂肪细胞分化过程中,加入1～50ng/mLTGFβ1后,成脂诱导体系中无脂肪细胞出现;在向成骨诱导过程中,加入20ng/mLTGFβ1后,钙化基质沉淀明显降低;在脂肪诱导体系中,MTT染色检测显示TGFβ1对CD105+细胞的增殖有明显促进作用(P<0.05)。结论TGFβ1抑制成人骨髓源CD105+MSCs向脂肪及成骨细胞分化,在向脂肪诱导过程中,TGFβ1促进MSCs的增殖。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的　建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法 ,诱导其表达软骨细胞表型。方法　抽取兔骨髓 ,经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导 ,观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果　①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁 ,可提高细胞分离率 ;②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合可促进MSCs增殖 ,表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论　①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF β1 ,IGF Ⅰ和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖 ,表达软骨细胞表型     

人骨髓间充质干细胞生物学特性及腺病毒介导的GFP标记

目的建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分离、培养以及鉴定的方法,同时应用腺病毒介导的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)检测细胞转染的效率。方法应用人淋巴细胞分离液(Ficoll)对hMSCs进行分离,经贴壁纯化后用MTT法检测增殖能力;并对其成骨、成脂、成平滑肌诱导分别进行碱性磷酸酶(ALP)、油红O染色及α-SMA免疫细胞化学检测;采用流式细胞仪(FCM)检测细胞表面标志的表达。用Ad-GFP转染,并应用荧光显微镜与FCM检测转染效率。结果 hMSCs镜下为成纤维样形态,约在第4天进入对数增长期;分化诱导后ALP染色、Von kossa银染、油红O染色以及α-SMA均为阳性;FCM检测CD14、CD31、CD45表达阴性,CD44、CD73、CD106及PDGFRβ表达阳性;当感染复数MOI=200,细胞培养48h时感染效率较高,FCM检测显示为99.81%。结论经过对增殖、分化能力以及表面标志的分析,证明用Ficoll可以分离得到较纯的hMSCs,Ad-GFP可以很好地感染细胞,为组织工程种子细胞的体内示踪提供了途径。     

ISOLATION AND INDUCTION OF RABBIT BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS TO EXPRESS CHONDROCYTIC PHENOTYPE

Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＭＳＣｓ)ｗｅｒｅｍｕｌｔｉｐｏ ｔｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｓ ,ｌｏｃａｔｅｄｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ ,ｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓ ｃｌｅａｎｄｓｙｎｏｖｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅ ,ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｔｅｉｎｔｏｓｅｖｅｒａｌｔｙｐｅｓｏｆｃｅｌｌｓ,ｓｕｃｈａｓｏｓｔｅｏｃｙｔｅ ,ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅａｎｄａｄｉｐｏｃｙｔｅ[1,2 ] .ＳｅｐｅｒａｔｉｏｎｏｆＭＳＣｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｖｅｎｉｅｔ ,ａｕｔ…     

骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定

目的建立兔骨髓间质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、扩增和鉴定的方法,为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础。方法抽取兔胫骨骨髓,密度梯度离心,得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞,经胰蛋白酶消化后传代培养扩增,倒置显微镜下观察原代和传代细胞的生长特性。通过免疫荧光组织化学、流式细胞分析和透射电镜鉴定细胞。结果分离培养的骨髓MSCs贴壁、呈梭形,原代细胞呈集落生长,7～10d达到融合,传代后增殖速度加快;骨髓MSCs表达CD90,反复传代后表达效率增高,不表达CD34;透射电镜可见细胞表面有大量的绒毛突起,胞浆中有丰富的粗面内质网和线粒体,核大,形态不规则。结论密度梯度离心结合贴壁法,以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,分离培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。     

胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较

目的探讨人胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的分离培养和生物学特性,为间充质干细胞(MSC)的选择和应用提供依据。方法采用酶消化法分离人胎盘组织,60 g/L羟乙基淀粉和密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别进行贴壁培养,观察不同来源MSC的生长、增殖和表面标志的表达并做比较。结果胎盘来源的贴壁细胞为一种混合性细胞,脐血单个核细胞体外培养可以获得形态不均一的贴壁细胞,二者在生长规律和形态学特征上与骨髓基质相比有一定差异性,CD106、CD44在三种细胞均有表达。结论胎盘和脐血来源的贴壁细胞具备间充质干细胞的基本特征。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及GFP转染标记

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,检测绿色荧光蛋白基因转染MSCs的瞬时表达及转染效率。方法应用Percoll密度梯度离心法分离大鼠MSCs,贴壁法不断纯化,流式细胞仪检测2代细胞表面CD34、CD71和CD90的表达,然后用pEGFP-N3与Lipofectamine 2000不同浓度比例转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率。结果①原代MSCs多呈纺锤形或梭形,有聚集生长的倾向,多3~5个细胞成为一个集落。传代后,细胞变为形态均一的排列有序的成纤维细胞样,长梭形,胞浆突起较少,胞体轮廓不甚清晰,胞体也相对较大;②GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达最强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达;③转染效率与质粒和脂质体的浓度比例有关,1∶2到1∶3最高。结论利用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;GFP转染是一种较好的MSCs标记方法。     

体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化

目的 建立体外非接触共培养模型,诱导小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向肺泡上皮细胞的分化.方法 分三组,每组6例.对照组:小鼠MSCs单独培养组;实验组A:正常肺组织单细胞悬液+MSCs;实验组B:损伤肺组织单细胞悬液+MSCs.共同培养8d,激光共聚焦和RT-PCR检测共培养体系下室中的SP-C和AQP5的表达情况.结果 对照组和实验组A都只检测到AQP5;而实验组B可同时检测到AQP5和SP-C.实验组B的AQP5 mRNA的表达量较对照组明显增多(P<0.01),而与实验组A比较,其AQP5 mRNA的表达量也有统计学差异(P<0.01).但是,实验组A与对照组比较则无明显统计学差异(P>0.05).结论 本实验室成功建立了体外非接触诱导小鼠MSCs分化为肺泡上皮细胞的实验模型.     

兔骨髓基质干细胞的体外培养及生物学活性研究

目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能.方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法,体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞,培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性,HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定;应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性.结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs,HE染色显示细胞均一性好;CD44强阳性表达,CD34阴性表达.诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性,ALP染色阳性;成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性,油红"O"脂肪染色阳性.结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力.