NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

NT4-ADNF-9融合基因原核表达载体的构建

目的　构建神经营养素 (NT4 )与活性依赖性神经营养因子 9(ADNF 9)融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9,为进一步对神经系统退行性疾病基因治疗的研究奠定基础。方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的ADNF 9的cDNA ,将其连接到NT的信号肽和前导序列的 3′端 ,组成融合基因NT4 ADNF 9,再将该融合基因亚克隆于原核表达载体pBV2 2 0 ,构建为pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。结果　经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将ADNF 9重组到NT4信号肽和前导序列的 3′端 ,并将融合基因亚克隆于pBV2 2 0内。结论　成功构建了NT4与ADNF 9融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。     

[Gly14]-Humanin的基因克隆及序列测定

目的利用基因工程方法对[Gly14]-Humanin进行基因克隆并测定其序列,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础。方法采用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的[Gly14]-Humanin的cDNA,将其克隆入pVAXI载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析,表明所插入的基因片断为[Gly14]-Humanin基因,与设计完全相同。结论成功地克隆了[Gly14]-Humanin基因。     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的研究,构建携带猪源性CTLA4Ig融合基因的重组腺病毒载体.方法 分离猪外周血单个核细胞,经RT-PCR扩增pCTLA4胞外段基因.将PCR产物克隆入pGH IgG,阳性克隆以双酶切及测序鉴定.将目的融合基因pCTLA4Ig克隆人腺病毒穿梭载体pSh...     

TAT-BACEsp-GFP三融合基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建穿膜肽基因和BACE底物肽融合基因与绿荧光融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础.方法 利用非对称互补引物/模板法制备两端含有酶切位点的TAT-BACEsp融合基因的cDNA,使之克隆到带GFP慢病毒表达载体质粒FUGW中,经限制性酶切和测序鉴定重组载体.结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实获得的TAT-BACEsp产物与设计的完全吻合;TAT-BACEsp准确克隆入FUGW的多克隆位点.结论 成功构建了TAT-BACEsp与GFP 融合基因慢病毒载体,为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗提供了适合的稳定转染的载体.     

β-淀粉样肽与乙型肝炎核心抗原融合基因Aβ-HBcAg表达载体的构建

目的　构建 β 淀粉样肽 ( β amyloidpeptide ,Aβ)与乙肝核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg ,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究和制备奠定基础。 方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的Aβ1- 42肽的cDNA ,将其连接到删除了Pre C区的HBcAg亚型ayw基因的N端组成融合基因Aβ HBcAg ,再将该融合基因亚克隆于载体 pBV2 2 0 ,构建为原核表达载体pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。 结果　经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将Aβ1- 42cDNA重组到HBVcore的N端 ,并将融合基因亚克隆于 pBV2 2 0内。 结论　成功构建了原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。     

人GLUT4基因的克隆及原核表达的初步实验研究

目的　通过反转录聚合酶链方法 ,从人新鲜手术肌肉组织获得人葡萄糖转运子 4 (GLUT4 )cDNA基因 ,并分别克隆入测序载体、表达载体 ,获得具有正确序列的目的基因及其原核表达产物 ,为其进一步的抗体制备、活性鉴定及研究应用奠定物质基础。方法　经GenBank在线检索 ,设计、确定人GLUT4cDNA基因特异引物 ,采用反转录聚合酶链 (RT PCR)方法从一例手术的人新鲜腹部肌肉组织总RNA模板中 ,获得人GLUT4表达片段cDNA的基因 ,经克隆入测序载体pGEM 3zf(- )测序 ,验证cDNA大小、完整性及序列。再克隆入表达载体 pBV2 2 0 ,经温度诱导 ,在E .coli获得表达。结果　以设计的特异引物 ,从人肌肉组织模板中能得到预期大小完整的人GLUT4cDNA基因 ,并能插入预定的克隆载体中测序 ,所得基因的序列与目的基因的序列相符。所获GLUT4cDNA基因插入原核非融合表达载体pBV2 2 0 ,获得预期大小的重组表达产物。结论　从人肌肉组织中能获得具有正确序列、含完整起始及终止密码的人GLUT4cDNA基因。该人GLUT4cDNA基因的体外重组体能在原核表达系统表达     

饰胶蛋白(Decorin)基因的cDNA克隆与表达

目的　通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因cDNA克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法　应用PCR技术从T细胞cDNA文库获得饰胶蛋白全长基因cDNA片段 ,并克隆到pUC1 9载体中 ,采用Sanger双脱氧末端终止法测定全部cDNA序列 ,将测序正确的饰胶蛋白cDNA序列插入pGEX 4T 1表达载体中 ,经BamHI和EcoRI双酶切后 1 2 %凝胶电泳鉴定 ,IPTG诱导表达产物经SDS PAGE分析。结果　克隆的饰胶蛋白cDNA序列与GenBank中AF1 3830 0记载的序列完全一致 ,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值(65 6KD)也一致并为可溶性蛋白。结论　本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了GST Decorin融合蛋白     

T细胞CTLA-4、TCRVβ8基因克隆、重组及表达

目的克隆Graves’病患者甲状腺组织T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8目的基因,重组为CTLA-4-TCRVβ8基因并表达出融合蛋白。方法RT-PCR从Graves病患者甲状腺组织中克隆T淋巴细胞的CTLA-4胞外段和TCRVβ8基因,依次与表达质粒进行连接,双酶切及测序鉴定获得正确的重组子;原核表达融合蛋白,SDS-PAGE及Western-Blotting检测蛋白表达情况。结果基因克隆扩增出CTLA-4和TCRVβ8目的基因片段,测序结果证实序列与已发表的一致。重组基因原核表达出与预期分子质量大小相符的目的蛋白。结论成功构建和表达了CT-LA-4-TCRVβ8基因,为探索Graves’病免疫耐受治疗提供了基因产品。     

为部队训练研发浮动目标靶等新装具的回忆

在内陆地区借助专用装具模拟海上浮动目标进行射击训练,从而有效地提高现役部队官兵和预备役指战员的实战技能。浮动靶标的研发成功地实现了这一预想。     

水泥粉煤灰稳定碎石合理级配分析

提出了粉煤灰改善混合料结构的理念,通过替代细集料的方式对3种不同级配设计的水泥粉煤灰稳定碎石混合料试验,研究分析表明:级配1混合料形成了较大程度的嵌挤密实结构,最大干密度和无侧限抗压强度最大,而采用了骨架密实结构的级配2混合料形成了不密实的多孔结构,最大干密度和无侧限抗压强度最低,悬浮密实型的级配3混合料最大干密度和无侧限抗压强度略低于级配1。     

利用MAS实现车辆动态识别与智能跟踪

针对视频图像车辆智能跟踪问题,提出了利用帧间差异积累动态矩阵进行自适应背景建模算法,采用背景差提取运动目标区域,设计了一种基于知识的多Agent智能系统进行目标分割、轮廓提取和空域滤波,增强了抗背景干扰能力,使获得的目标区域具有更好的空域连通特性;通过自适应核窗宽改进了MeanShift算法的收敛速度,利用SSD算法实现了快速初始定位。实验结果表明,该方法自治能力强,跟踪目标快速准确,实时有效。     

沥青路面常见病害的防治和相应设备使用工艺

沥青混凝土路面是当前道路的主要形式,基于工程实践,对其常见病害的产生机理进行分析,从而提出处理这些病害的工艺及适用设备。     

浅议影响汽车综合性能检测结果的几个因素

简述了汽车综合性能检测中影响检测结果5个方面的因素,提出了公司为保证检测结果的公正性、科学性而采取的措施。     

监控量测技术在长逢沟隧道施工中的应用与数据分析

长逢沟隧道为一座左、右线分离的四车道高速公路长隧道,地质情况复杂,围岩软弱破碎,总体较差,Ⅲ级围岩仅占32.86%,Ⅳ、Ⅴ级围岩占67.14%,且穿越3个大断裂带,埋深较浅.根据新奥法施工原理及隧道施工实际情况,在施工过程中严格地、系统地采用监控量测技术指导施工,以现场监控的围岩观察、拱顶下沉、水平收敛、地表下沉等数据...     

王繁高速公路太安岭隧道涌水量预测与评价

以太安岭隧道为例,利用地下水动力学方法对隧道开挖的涌水量进行了预测,预测结果表明,隧道全线属于弱富水段,根据预测结果提出了隧道施工建议。     

水泥稳定冷再生材料路用性能试验研究

通过室内试验对水泥稳定冷再生混合料的无侧限抗压强度、抗压回弹模量、劈裂强度、抗冻性能进行了系统的研究,同时研究了水泥剂量、旧料掺加比例、温度对水泥稳定再生混合料的影响.研究表明,水泥剂量为5%时,冷再生材料的强度和其他路用性能指标均满足规范的要求.     

水泥稳定碎石配合比设计方法的研究

水泥稳定碎石在我国公路工程中有着广泛的应用,对比分析了两种不同的水泥稳定碎石配合比设计方法,以成型原理、试件最大干密度、试件强度为切入点,充分证明了室内采用振动压实法对提高半刚性基层的路用性能有明显的作用,最后结合试验路工程,总结了水泥稳定碎石振动压实法的施工工艺。     

某岩质边坡失稳机理分析及处置措施研究

通过对现场失稳岩质边坡的调查,简述了边坡存在的隐患,对其进行了失稳机理分析,根据工程特点设定了治理目标及治理方案,并简要阐述了施工工程布置方案,对类似的工程有一定的指导作用。