定向基因传递载体pET15b-Z-VP1的构建

目的 在JCV VP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区),构建原核表达质粒pET15b-Z-VP1.方法 PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将Z-VP1片段插入原核表达质粒pET15b.结果经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化,分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成Z-VP1重组基因;双酶切将Z-VP1插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间,并经酶切鉴定和DNA测序证实.Western blotting证明pET15b-Z-VP1在体外表达重组蛋白VP1-Z.结论成功在VP1氨基末端插入Z区,构建了原核表达质粒pET15b-Z-VP1,并体外表达重组蛋白VP1-Z.     

GM-CSF基因修饰的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF的构建

目的构建能分泌表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF。方法将T-h GM-CSF重组质粒转化入感受态大肠杆菌中,筛选出耐药性单克隆菌落送测序。利用PCR技术扩增出GM-CSF目的基因片段,将PCR产物连入pGEM-T easy载体,转化入大肠杆菌中扩增,用SDS碱裂解法提取Teasy-GM-CSF重组质粒,用限制性内切酶酶切Teasy-GM-CSF重组载体,连入经相同酶酶切的pLXSN反转录病毒载体中。用磷酸钙沉淀法转染PA317包装细胞系进行病毒包装,用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19细胞,经G418加压筛选感染成功的NuTu-19/GM-CSF细胞,用免疫细胞化学和ELISA法检测NuTu-19/GM-CSF分泌表达GM-CSF蛋白的情况。结果T-h GM-CSF重组质粒测序结果与GenBank Accession#:NM_000758基因序列对比后确定为人类GM-CSF基因编码序列;PCR产物酶切电泳在Mark 400-500 bp中有一条带,符合GM-CSF基因序列长度;重组Teasy-GM-CSF质粒用EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶酶切后,电泳鉴定在400-500 bp之间有一目的条带,重组反转录病毒质粒pLGM-CSFSN酶切电泳有目的条带;G418加压筛选感染后的NuTu-19细胞,14 d后慢慢形成单克隆继续生长;免疫细胞化学检测到感染成功的NuTu-19细胞膜表面有明显的棕褐色颗粒沉淀,ELISA法检测细胞培养上清液中GM-CSF的质量浓度为150 pg/mL。结论成功构建了能分泌表达人GM-CSF蛋白的卵巢癌细胞NuTu-19/GM-CSF,为以后研究卵巢癌免疫治疗提供必备、有效、可靠的工具基础。     

携带CIP2A shRNA重组腺相关病毒载体的构建及其鉴定

目的构建携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体,制备靶向性沉默CIP2A表达的高浓度重组腺相关病毒。方法设计合成CIP2AshRNA,退火形成双链与pDC316-EGFP-U6质粒BamHⅠ和HindⅢ双酶切产物相连接构建形成质粒pDC316-EGFP-CIP2AshRNA,以鉴定正确的pDC316-EGFP-CIP2AshRNA克隆为模板PCR扩增EGFPCIP2AshRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切PCR扩增产物及pSNAV2.0质粒后进行连接形成重组质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA,建立载体细胞株BHK/CIP2A-shRNA,采用AAV MaxTM包装系统大规模制备rAAV2-EGFPCIP2AshRNA并对其纯化及滴度测定。将rAAV2-EGFP-CIP2AshRNA感染肝癌细胞HepG2,利用空载病毒载体rAAV2-EGFP作对照,采用Real-time PCR及Western blot方法检测CIP2AshRNA基因沉默效果。结果携带编码CIP2AshRNA腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-EGFP-CIP2AshRNA经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;将重组质粒与辅助病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-21,成功制备重组腺相关病毒rAAV2-CIP2AshRNA,经测定纯化所得rAVV2病毒滴度为0.25×1012v.g./mL。筛选MOI值为1×105感染肝癌细胞HepG2,CIP2A mRNA及蛋白表达水平分别于感染后24h和48h与对照细胞相比出现明显下降。结论成功制备高滴度携带CIP2AshRNA重组腺相关病毒载体rAAV2-CIP2AshRNA。     

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。     

pcDNA3.1(+)/caveolin-1真核表达质粒的构建及其在MCF-7乳腺癌细胞株中的表达

目的明确正常组织和人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1的表达情况,构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1表达质粒,并鉴定其表达。方法 RT-PCR法检测9种正常人体组织及人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1基因的扩增情况;Western blotting法检测MCF-7细胞中caveolin-1蛋白的表达情况。设计克隆引物和表达引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,用EcoRⅠ+XbaⅠ内切酶消化回收PCR产物和质粒pcDNA3.1(+),连接后构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒。挑选pcDNA3.1(+)/caveolin-1转染感受态细菌后的单菌落进行PCR鉴定,阳性菌落培养后提取质粒行酶切鉴定及测序鉴定。瞬时转染MCF-7细胞后Western blotting检测caveolin-1蛋白的表达情况。结果①9种正常组织中均有caveolin-1基因扩增,MCF-7细胞中无caveolin-1基因扩增且无蛋白表达;②pcD-NA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒转染MCF-7细胞后caveolin-1蛋白表达良好。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞后caveolin-1表达稳定。     

重组人突变型471TNF—α及野生型TNF—α表达及活性初步鉴定

目的 采用原核表达系统，表达人突变型471TNF－α蛋白，并检测其生物学活性。方法 采用PCR技术扩增突变型471TNF－α及野生型TNF－α cDNA片段，克隆入中间载体pUCm-T中，并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段，克隆入pBV220中，转入大肠杆菌DH5α，温度诱导表达野生型及突变型471TNF－α蛋白。初步纯化蛋白后，采用MTT法评估两者对L929细胞的杀伤作用。结果 ①获得了测序正确的野生型TNF－α及突变型471TNF－α的cDNA克隆；②构建了正常人野生型TNF－α及突变型471TNF－α重组表达质粒；③经温度诱导，TNF－α及突变型471TNF－α蛋白均获得了表达；④初步的生物学活性研究表明，突变型471TNF-α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论 突变型471-α的生物学活性优于野生型TNF－α，为进一步开展TNF－α的基础及临床研究奠定了基础。     

hGPx-1-198Leu真核表达载体的构建与鉴定及在H9C2细胞中的表达

目的构建含有人GPx-1基因Pro198Leu多态的真核表达载体,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制提供依据。方法采用全基因合成的方法合成含多态位点的人GPx-1基因cDNA片段,同时在基因5′端和3′端分别引入BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,通过限制性内切酶酶切目的片段和真核表达载体pEGFPN3,再用T4DNA连接酶将含有目的基因的片段定向插入到载体pEGFP-N3真核人巨细胞病毒启动子下游。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆、提取质粒进行鉴定。将hGPx-1-198Leu真核表达载体转染HEK293细胞,观察转染效率,并采用RT-PCR检测转染重组载体后细胞中GPx-1的mRNA表达水平。重组载体转染H9C2细胞,观察补硒之后的GPx-1表达情况。结果获得目的基因cDNA片段全长869bp,PCR和测序鉴定载体中含有人GPx-1-198Leu基因cDNA。重组载体转染HEK293细胞后检测到GPx-1的mRNA水平比未转染组及空质粒转染组明显升高,为深入研究GPx-1基因Pro198Leu多态在相关疾病中的作用与机制奠定了基础。H9C2细胞在转染后GPx-1蛋白水平升高并且随着硒浓度的升高而升高。结论成功构建了含Pro198Leu多态位点的hGPx-1真核表达载体,并且也插入了保证该基因有效表达的硒代半胱氨酸插入序列。     

HPV-6/11 L1/E6、HPV-6/11 L1/E7嵌合DNA疫苗质粒的构建

目的　构建HPV 6 / 11L1/E6、HPV 6 / 11L1/E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法　运用PCR扩增HPV 6 /11L1、E6、E7序列 ,PCR产物连接至pGEMT Easy质粒 ,测序鉴定正确后 ,分别连接至真核表达载体pVAX ,再用酶切、连接而构建成HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX质粒。运用电穿孔法将所获得质粒转染COS 7细胞 ,免疫组化检测蛋白表达情况。结果　所构建质粒的插入目的片段测序正确 ;免疫组化检测在胞浆胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论　所构建的HPV 6 / 11L1 E6 /E7 pVAX融合蛋白表达质粒可在体外表达L1 E6 /L1 E7蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的动物实验及临床实验研究做好准备     

牙龈卟啉菌蛋白酶rgp Acd基因表达载体的构建

目的构建牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)基因的表达载体。方法利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd,插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片断插入原核表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b/rgpAcd,通过限制性酶切鉴定。结果PCR产物电泳结果显示,在大约1.5 kb处有一特异的条带,与预期的大小一致,核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性,未发生任何突变;构建的表达质粒经酶切后所得片断与预期大小一致,表明牙龈卟啉菌蛋白酶rgpAcd基因的表达载体构建成功。结论成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd基因并构建了表达载体,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR扩增BACE特异性小干扰RNA,转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒,再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE。结论pLXSN/EGFP-U6-siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。     

重组人突变型471TNF-α及野生型TNF-α的表达及活性初步鉴定

目的　采用原核表达系统 ,表达人突变型 471TNF α蛋白 ,并检测其生物学活性。方法　采用PCR技术扩增突变型 471TNF α及野生型TNF αcDNA片段 ,克隆入中间载体pUCm T中 ,并测序证实。以限制性内切酶切下目的片段 ,克隆入pBV2 2 0中 ,转入大肠杆菌DH5α ,温度诱导表达野生型及突变型 471TNF α蛋白。初步纯化蛋白后 ,采用MTT法评估两者对L92 9细胞的杀伤作用。结果　①获得了测序正确的野生型TNF α及突变型 471TNF α的cDNA克隆 ;②构建了正常人野生型TNF α及突变型 471TNF α重组表达质粒 ;③经温度诱导 ,TNF α及突变型 471TNF α蛋白均获得了表达 ;④初步的生物学活性研究表明 ,突变型 471TNF α蛋白的杀伤作用显著高于野生型。结论　突变型 471TNF α的生物学活性优于野生型TNF α ,为进一步开展TNF α的基础及临床研究奠定了基础     

人促甲状腺激素受体胞外段的体外重组、蛋白高效表达及其与构象功能的关系

目的　TSH受体 (TSHR)是诱发自身免疫性甲状腺病 (autoimmunethyroiddisease ,AITD)的主要自身抗原。TSHR上TSH结合部位、自身抗体及主要的B细胞、T细胞表位均位于其胞外段部分。本研究利用基因重组方法 ,建立人TSH受体胞外段 (hTSHRecd)体外高效表达、纯化系统 ,用于Graves’病的临床及实验研究 ,探索体外表达的重组hTSHRecd蛋白的免疫生物活性与其空间构象的关系。方法　设计 1对hTSHRecd特异性引物 ,自PCRTTM3 hTSHR载体中PCR扩增合成hTSHRecd片段 ,经限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ消化 ,胶回收纯化后 ,重新构建于表达质粒 pQE 30中。用质粒电泳、限制性内切酶消化、PCR 3种方法鉴定重组质粒是否构建正确 ,并于E .coliM15细胞进行诱导表达。所表达的 6×His hTSHRecd融合蛋白经 12 0 g·L-1SDS PAGE ,Westernblotting鉴定。细菌培养产物经超声波破碎、裂解液裂解后利用Ni NTA树脂 ,经金属螯合层析法纯化 ,并经原位再折叠、透析、浓缩等处理。以ELISA、12 5I TSH结合抑制试验检测纯化蛋白与Graves’甲亢患者血清及TSH的结合活性。结果　经鉴定 ,重组质粒中含有以正确方向插入的 12 0 5bp的hTSHRecdcDNA基因片段。hTSHRecd融合蛋白约 4 7kD ,于 12 0 g·L-1SDS PAGE可见深染的特异性蛋白条带 ,可与Graves?     

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组载体的构建

目的设计构建携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的cDNA融合基因的重组载体,为针对Survivin的靶向治疗奠定基础。方法应用非对称引物/模板法、PCR技术制备NT4-Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片断,连接于pGEM-T-Easy载体,经克隆测序、酶切后与PBV220/NT4质粒连接;转化感受态细胞E.coliDH5α,亚克隆获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因。结果克隆出Ant-Shepherdin[79-87]基因,经酶切及测序证实结果正确;连接PBV220/NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因片断。结论通过分子生物学技术成功构建了携带NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。     

人神经生长因子的基因克隆和序列分析

目的　克隆人神经生长因子基因编码区。方法　由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果　经质粒DNA酶切分析及序列测定 ,获得了人神经生长因子DNA片段序列。结论　首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因 ,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件。     

人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒载体,为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒,再将其与酶切线性化的pDC315-3Flag载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag;应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒,进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定;用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag的构建;再通过荧光显微镜和Western blot方法,分别检测质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP-1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析,证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag与设计一致;穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后,经Western Blot均检测出在95¹30ku处有条特征带,其大小和NRP-1-3Flag融合蛋白(104ku)相吻合;滴度测定为2.00E+11PFU/mL。结论成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达。     

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以EcoRⅠ和BamHⅠ将腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%～94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10~(13)vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的hTSHR289蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。     

脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒,并对其表达和定位进行研究.方法 以人血白细胞DNA为模板,利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段,并将其与pEGFP-N1质粒载体连接,构建BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒.以脂质体Lipofectamine2000 转染Hela细胞,提取总RNA,通过RT-PCR方法检测BDNF-EGFP在转录水平的表达,Western blot 及荧光显微镜进一步观察融合蛋白的表达定位.结果 酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中,转染Hela细胞后,RT PCR证实BDNF EGFP融合蛋白在转录水平有表达,荧光显微镜观察显示BDNF EGFP融合蛋白主要分布于细胞质中,Western blot结果显示Hela细胞培养液中有BDNF EGFP融合蛋白存在. 结论成功构建了BDNF EGFP融合蛋白真核细胞表达质粒,BDNF EGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达,主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外.     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得366bp的核心蛋白基因片段。将其插入连接载体pMD18-T vector中,酶切后再与表达载体pBV220连接,构建重组表达载体pBV220/HCV-C。经鉴定后温度诱导表达,采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测核心蛋白基因的蛋白表达。结果经温度诱导后获得目的基因的非融合表达,SDS-PAGE电泳显示在14000 u处有一表达条带;Western-blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论丙型肝炎病毒核心蛋白基因成功表达,对临床诊断试剂和HCV基因疫苗的研制有一定的意义。     

NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。