人神经生长因子重组腺伴随病毒载体的构建

目的　为了研究人神经生长因子 (hNGF)基因导入急性脊髓损伤 (SCI)模型的治疗作用 ,构建并产生重组腺伴随病毒 (AAV)载体。方法　将hNGF外源性核酸片段插入AAV shuffer质粒 pSSHG Neo的KpnⅠ BamHⅠ位点构建AAV。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的pSSHG Neo三质粒磷酸钙共沉淀法在肾胚胎 2 93细胞系中同源重组包装rAAV。使用地高辛标记的斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　成功构建了重组病毒质粒pSSHG/hNGF ,经蔗糖梯度离心法获得rAAV组分 ,梯度稀释测得滴度为 1.4 6× 10 12 PFU·mL-1。结论　成功地制备了人神经生长因子重组腺伴随病毒 (rAAV/hNGF)载体 ,为SCI基因治疗实验奠定了基础。     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以EcoRⅠ和BamHⅠ将腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%～94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10~(13)vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的hTSHR289蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。     

含hITF基因cDNA的腺病毒载体的构建及其感染肠上皮细胞的研究

目的构建含有人肠三叶因子基因cDNA的腺病毒载体,并观察其对肠上皮细胞的感染能力。方法利用PCR技术扩增hITF基因cDNA全长序列,测序后亚克隆至腺病毒穿梭质粒,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1大肠杆菌株BJ5183感受态细胞中进行同源重组,内切酶PmeⅠ线性化后转染HEK293细胞进行病毒包装及扩增,并进行滴度测定。将重组腺病毒感染肠上皮细胞(HT-29),荧光显微镜观察感染效果。结果成功构建出重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hITF,PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,PacⅠ酶切鉴定后命名为Ad-hITF;重组腺病毒载体在HEK293细胞中包装,获得重组腺病毒颗粒;根据Karbers公式计算病毒颗粒滴度为2×109 pfu/mL;重组腺病毒可以感染肠上皮细胞(HT-29),感染效率较高。结论成功构建含hITF基因cDNA的重组腺病毒载体并获得大量子代重组腺病毒,为腺病毒介导hITF基因治疗的应用打下基础。     

人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒载体的构建

目的为了研究人骨形态发生蛋白-7(hBMP7)导入骨缺损模型中的治疗作用,构建重组腺病毒载体。方法将hBMP7基因全长定向克隆入穿梭质粒pACCMV-plpA,构建pACCMV/rhBMP7穿梭质粒,应用磷酸钙-DNA共沉法将穿梭质粒及包装质粒PJM17共转染293细胞,经细胞内同源重组后,构建骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pAC-CMV/rhBMP7。结果成功构建了重组质粒pACCMV/rhBMP7,经293细胞包装后,扩增纯化测定病毒滴度为1×1011pfu/mL。结论成功构建人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7,为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。     

携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建

目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒,为探讨AcSDKP(乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸)的多样化功能提供基础。方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板,PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段,插入腺相关病毒载体穿梭质粒pSSHG-CMV,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞,包装rAAV-NT4-AcSDKP,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。结果成功合成NT4-AcSDKP基因,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP,包装获得滴度为3.40×1010 copies/mL的重组腺相关病毒。结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒,为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。     

2型腺伴随病毒基因治疗载体的构建

目的　构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法　以野生型 2型腺伴随病毒 (AAV 2 )质粒pssv9int 及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件 ,利用重组DNA技术 ,构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG Neo。结果　该质粒除含有必备的原核细胞复制子及Ampr 筛选基因外 ,还含有真核细胞筛选基因———Neor 及供插入目的基因的多克隆位点 (MCS) ,在MCS的上游为逆转录病毒的长末端重复序列 (5’LTR) ,具有启动子的功能 ,启动定向插入到MCS的外源目的基因。质粒中的AAV反向末端重复序列 (ITR)具有定点整合于人基因组 1 9号染色体S1位点的特点。结论　AAV载体是具有广阔前景的基因治疗载体     

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。     

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。     

一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表达的研究

以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2，转染A549细胞后表达了人白细胞介素-2基因。为应用腺伴随病毒作基因治疗研究提供了实验基础。     

猪源性CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 为进行基因转移阻断T细胞共刺激通路诱导异种胰岛细胞移植免疫耐受的研究,构建携带猪源性CTLA4Ig融合基因的重组腺病毒载体.方法 分离猪外周血单个核细胞,经RT-PCR扩增pCTLA4胞外段基因.将PCR产物克隆入pGH IgG,阳性克隆以双酶切及测序鉴定.将目的融合基因pCTLA4Ig克隆人腺病毒穿梭载体pSh...     

CONSTRUCTING AAV-TGFβ1 AND COMPARISING ITS BIOLOGICAL EFFECTS ON PROTEOGLYCAN SYNTHESIS OF NUCLEUS PULPOUS CELLS WITH AV-TGFβ1

Objective To construct adeno-associated virus express system for TGFβ1 (AAV-TGFβ1) and compare its biological effects on proteoglycan synthesis of the rabbit lumbar disc nucleus pulpous (NP) cells with adenovirus (Ad) express system for TGFβ1 (AV-TGFβ1). Methods TGFβ1 gene was obtained by polymerase chain reactions (PCR). The upstream of TGFβ1 contained restriction enzyme site of EcoR Ⅰ, and the restriction enzyme site of Sal Ⅰ was at the downstream of TGFβ1. Using the multiple cloning sites (MCS) in plasmid AAV and the corresponding contained restriction enzyme site in PCR product of TGFβ1, TGFβ1 gene was subcloned into AAV. The recombinant plasmid AAV-TGFβ1 was detected by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Then, AAV-TGFβ1 virus was packaged and TGFβ1 expression mediated by AAV was detected by immunofluence analysis in H293 cells. AAV transfection rate to NP cells was evaluated with AAV-PEGF. After NP cells were respectively transfected by AAV-TGFβ1 virus and AV-TGFβ1 virus, proteoglycan synthesis was detected and compared by using Antonopulos methods. Results DNA sequencing revealed that the PCR-amplified TGFβ1 gene was consistent with NCBI Gene Bank. The recombinant plasmid was proved to be constructed successfully by restriction enzyme digestion. AAV could be transfected into NP cells and mediate an efficient expression of TGFβ1 protein. AV-TGFβ1 virus could quickly enhance the proteoglycan synthesis of the NP cells, but its biological effect was transient. AAV-TGFβ1 virus could enhance stably proteoglycan synthesis. Conclusion AAV-TGFβ1 virus was successful constructed and enhanced stably proteoglycan synthesis of NP cells.     

小鼠肌肉组织特异性微小RNA miR-133a腺病毒表达载体的构建及表达

目的制备小鼠肌肉组织特异性微小RNA miR-133a的腺病毒表达载体并观察其在HeLa细胞的表达。方法利用PCR技术从小鼠基因组DNA扩增miR-133a前体对应的基因组片段,克隆到质粒pAdTrack-CMV,而后以同源重组的形式插入到腺病毒表达载体,由人胚肾293细胞包装,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。重组腺病毒感染HeLa细胞后,利用Northern blot检测miR-133a成熟分子的表达。结果①成功构建穿梭质粒pAdTrack-miR-133a;②成功构建重组腺病毒质粒pAdeasy-miR-133a;③293细胞包装获得有感染能力的重组腺病毒;④转染的HeLa细胞能够高效表达成熟miR-133a。结论构建了小鼠miR-133a的腺病毒表达载体,证实其转染HeLa后的表达,为后续研究miR-133a的功能打下了基础。