RD-PCR技术在酵母基因表达谱研究中的应用

目的　应用RD PCR技术分离酵母基因。方法　首先提取酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)总RNA ,纯化mRNA ;然后 ,反转录成双链cDNA ;再用限制性内切酶Sau3AI酶切 ,在酶切片段上加上接头后 ,用通用引物U进行第一次PCR扩增 ,以这一产物为模板用选择性引物(在通用引物的 3’端延伸两个碱基 )作第二次PCR扩增。 5 %PAGE胶分离基因片段 ,选择单带割胶回收 ,做第三次PCR扩增 ,与载体连接 ,最后进行测序分析。结果　采用这种方法分离得到的基因片段 ,经Blast检索分析 ,确为来自酿酒酵母基因的cDNA片段或表达序列标签 (EST)。结论　RD PCR技术可以有效地分离EST ,可用于酵母基因表达调控的研究。     

人ECK基因外显子3的实验研究

目的　建立人eck基因外显子 3(exon 3)的克隆与鉴定方法 ,研究其在ZR 75 1细胞系中的突变情况。方法　设计一对eck基因exon 3特异性引物 ,提取人正常皮肤组织和乳腺癌细胞系ZR 75 1基因组DNA ,并以此作为模板 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增eck基因exon 3片段 ,克隆入中介载体pUCm T中构建重组质粒 ,转化JM10 9大肠杆菌 ,扩增后经酶切、PCR初步鉴定后 ,进行序列分析。结果　①从正常皮肤组织上皮细胞、ZR 75 1细胞系基因组DNA中 ,经PCR扩增 ,获得了人eck基因exon 3片段 ;②建立了正常皮肤组织、ZR 75 1细胞系eck基因exon 3片段的克隆 ;③ZR 75 1细胞系中eck基因exon 3片段存在突变。结论　从人组织与细胞系基因组DNA中 ,成功地构建了人类eck基因exon 3的克隆 ,并证实eck基因exon 3在ZR 75 1乳腺癌细胞系中有突变 ,为进一步研究eck基因exon 3在肿瘤形成中的作用奠定了基础     

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体基因的构建、表达及空间构象分析

目的　扩增出抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)单克隆抗体 (mAb)的重链可变区 (VH)单域抗体基因 ,并进行原核表达及空间构象分析。方法　从分泌抗γ SmmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA ,经RT PCR扩增VH 单域抗体基因 ,将其克隆到融合蛋白表达载体 pGEX 4T 1中进行表达 ,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果　VH 单域抗体基因全长 363bp ,含起始码和终止码。将其克隆到 pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5α ,获得高效表达 ,表达量占全菌总蛋白质的 38% ,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后 ,用谷胱甘肽 (GST)亲和色谱纯化 ,再经凝血酶水解获得抗γ SmVH 单域抗体。竞争结合抑制实验证明 ,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示 ,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论　构建成功抗γ Sm的VH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。     

小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法　以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以人T淋巴细胞为靶抗原 ,对该库进行了 3轮淘洗 ,ELISA方法鉴定噬菌体抗体。结果　成功构建了最大实际库容量为 1 .75× 1 0 6的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库。结论　所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体。     

K562细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的　构建K5 6 2细胞表达型cDNA文库。方法　提取K5 6 2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5’端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的λgt11噬菌体连接 ,体外包装后建成cDNA文库。取出 1μL倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果　构建成含 1.0 2× 10 6重组子的K5 6 2细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.3kb。结论　所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆。     

Graves病自身免疫单链抗体库的构建及抗甲状腺单抗的筛选

目的　Graves病属于甲状腺自身免疫性疾病 (AITD) ,其患者血中存在多种抗甲状腺自身抗体 ,其中包括TGAb、TPOAb以及TRAb。单链抗体 (ScFv)是以连接肽将重链可变区基因 (VH)和轻链可变区基因 (VL)连接起来形成的单链小分子抗体。为了获得人源性抗甲状腺抗体 ,分析其基因结构 ,进一步研究AITD的发病机理 ,我们构建了人源性噬菌体ScFv库。方法　采取Graves病人静脉血 ,用淋巴细胞分层液按常规分离单个核细胞。提取淋巴细胞总RNA逆转录合成cDNA。分别扩增出全套的免疫球蛋白VL 链和VH 链基因 ,利用重叠PCR方法 ,构建ScFv基因。重组到 p3SCMH嗜菌粒中 ,电穿孔转化XL1 Blue大肠杆菌。经适当培养后 ,加入约 10 12 空斑形成单位 (PFU)的辅助噬菌体VCSM13,构建噬菌体抗体库。测定库容 ,鉴定重组率。以固相化的抗原对噬菌体ScFv库进行了 4轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,富集特异性噬菌体抗体。用ELISA竞争抑制实验检测富集的噬菌体抗体。结果　以单链cDNA为模板 ,用PCR方法分别扩增VL 链和VH 链的DNA。PCR产物经 15g·L-1琼脂糖电泳检测 ,分别在 380bp和 4 2 0bp左右见到扩增带。将VL 和VH 进行重叠PCR制备ScFv ,琼脂糖电泳显示PCR产物在 80 0bp左右有扩增带。将ScFv基因纯化 ,用SacⅠ+SpeⅠ双酶消化后 ,重组到 p3     

用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库

目的构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库。方法体外致敏并用EB病毒(EBV)转化肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。RT-PCR扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,将抗体基因分别与载体pComb3连接后,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建噬菌体呈现型Fab抗体库。结果经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生;经PCR扩增出13条轻链基因片段(κ、λ)和28条重链Fd基因片段(γ);电转化构建的噬菌体抗体库库容为1.7×107puf/mL;Fab基因的重组率约为100%。结论用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,成功构建了全人源抗肝癌Fab组合抗体文库。     

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定

目的用含丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体,并进行人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定。方法PCR扩增含HCV core蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。扩增人胎肝cDNA文库并纯化、鉴定。结果获得含HCVcore蛋白的cDNA片段,并成功克隆入pGBKT7中。待转化的人肝cDNA文库滴度在5×108左右,纯化后的质粒DNA质量浓度约1 g/L。用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切显示插入片段大小不一。结论成功构建了核心蛋白的酵母双杂交诱饵载体;扩增、纯化的人胎肝cDNA文库的多样性很好,适合于筛选。为用酵母双杂交技术研究与HCV core蛋白相互作用的蛋白打下坚实基础。     

逆转录病毒介导CXCR4-siRNA对前列腺癌细胞体外侵袭能力的影响

目的设计构建趋化因子受体4(CXCR4)的RNA干扰逆转录病毒载体,探讨干扰CXCR4表达对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。方法用PCR扩增CXCR4特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的Pgensil-1质粒中,再将重组基因片段导入到逆转录病毒真核表达载体PLX-SN中,行限制性酶切及测序鉴定。重组逆转录病毒载体转染包装细胞PA317,获取病毒上清转染前列腺癌细胞,RT-PCR检测CXCR4mRNA表达。Transwell小室侵袭实验检测前列腺癌细胞体外侵袭能力的变化。结果通过酶切及测序鉴定,成功构建了PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4。干扰质粒抑制CXCR4mRNA的表达,与空载体组比较,PC-3m、LNCaPsiRNA对CXCR4mRNA的抑制率分别为(84.26±10.20)%和(88.17±11.23)%。Transwell侵袭实验结果显示,干扰组微膜下孔细胞数PC-3m、LNCaP分别为(14.7±3.1)和(18.9±4.2)个,空载体组分别为(46.9±5.3)和(66.7±6.0)个,两者差异显著(P<0.05)。结论PLXSN/EGFP-U6-siCXCR4可以有效地抑制前列腺癌细胞CXCR4mRNA的表达,干扰CXCR4可以显著抑制前列腺癌细胞体外侵袭转移能力。     

人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析

目的　克隆人脑源性神经营养因子 (hBDNF)基因并进行序列分析。方法　提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板 ,应用PCR技术和T 载体克隆法克隆hBDNF基因 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定 ,并进行序列测定和分析。结果　DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列 (M6 1 1 81 )比较 ,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp ,序列完全相同。结论　自人基因组DNA中克隆hBDNF基因 ,为进一步开展阿尔茨海默病 (AD)的基因治疗积累了资料。     

人杀菌渗透增强性蛋白N末端片段在大肠杆菌中的表达

目的构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI)N-端193个氨基酸的重组表达质粒,诱导表达BPI193重组蛋白。方法应用RT-PCR的方法从HL-60细胞内扩增出BPI氨基端1-193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI193基因片段定向克隆入原核表达载体PET-28a中,构建重组的原核表达质粒PET-BPI193,转化大肠杆菌BL21菌株,用IPTG诱导表达蛋白。应用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析蛋白占菌体总蛋白百分比;Western-blot技术检测表达蛋白的特异性。结果从HL-60细胞中扩增得到579bp的BPI193基因片段,构建了T-BPI193亚克隆和PET-BPI193重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导,经SDS-PAGE检测表明,成功表达了6His-BPI193融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的12%。Western-blot检测显示表达产物具有特异性。结论成功构建了PET-BPI193重组表达质粒。在大肠杆菌BL21内,诱导获得了BPI193与组氨酸融合表达的重组蛋白。     

葎草花粉cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建葎草花粉cDNA表达文库,为进一步筛选葎草花粉的主要致敏蛋白组分、制备重组变应原奠定基础。方法采集新鲜葎草花粉,过筛后液氮保存,利用Trizol法抽提葎草花粉总RNA,纯化后PCR法反转录合成cDNA。经SfiⅠ酶切,过凝胶柱层析,去除小于400 bp的片断,收集大于400 bp的cDNA片段,加工后与λTripIEx2连接,文库体外包装,取出一小部分感染宿主菌XL1-Blue MRF,检测文库容量;PCR分析插入的cDNA片段的大小及多样性。结果成功构建一个含有5×105重组子的葎草花粉表达文库,重组率为90%,平均插入片段长度约为1.02 kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选克隆的目的cDNA。     

霜天蛾cDNA表达文库的构建和初步鉴定

目的构建霜天蛾cDNA表达文库,为进一步筛选霜天蛾主要变应原、制备重组变应原奠定基础。方法利用Trizol法抽提霜天蛾RNA,经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后得到mRNA,反转录合成dscDNA,连接EcoRⅠ接头,末端磷酸化,XhoⅠ消化,将双末端黏性化的双链dscDNA经过凝胶柱层析,收集大于400bp的cDNA片段,加工后与UniZAPXRVector连接,经过体外包装,感染宿主菌,构建cDNA文库,检测文库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入的cDNA片段大小进行分析。结果成功构建了一个含有5×105重组子的霜天蛾表达文库,重组率为67%,平均插入片段长度约为1.49kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选目的cDNA克隆。     

沙眼衣原体D型MOMP基因的克隆和序列分析

目的　从D型沙眼衣原体培养物中克隆主要外膜蛋白(MOMP)基因。方法　利用细胞培养法扩增沙眼衣原体后,提取基因组为模板,经聚合酶链反应(PCR)扩增全长MOMP基因,并用酶切、PCR扩增及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果　成功扩增了MOMP基因,并插入克隆载体 pUCmT中。结论　MOMP基因的克隆为进一步开展沙眼衣原体的疫苗研究奠定了基础。