pcDNA3.1(+)/caveolin-1真核表达质粒的构建及其在MCF-7乳腺癌细胞株中的表达

目的明确正常组织和人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1的表达情况,构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1表达质粒,并鉴定其表达。方法 RT-PCR法检测9种正常人体组织及人乳腺癌细胞株MCF-7中caveolin-1基因的扩增情况;Western blotting法检测MCF-7细胞中caveolin-1蛋白的表达情况。设计克隆引物和表达引物,RT-PCR法扩增caveolin-1基因,用EcoRⅠ+XbaⅠ内切酶消化回收PCR产物和质粒pcDNA3.1(+),连接后构建pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒。挑选pcDNA3.1(+)/caveolin-1转染感受态细菌后的单菌落进行PCR鉴定,阳性菌落培养后提取质粒行酶切鉴定及测序鉴定。瞬时转染MCF-7细胞后Western blotting检测caveolin-1蛋白的表达情况。结果①9种正常组织中均有caveolin-1基因扩增,MCF-7细胞中无caveolin-1基因扩增且无蛋白表达;②pcD-NA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒转染MCF-7细胞后caveolin-1蛋白表达良好。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/caveolin-1重组表达质粒,瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞后caveolin-1表达稳定。     

Desmin基因exon6 A360P错义突变与克山病的关系

目的探讨Desmin基因exon6的A360P错义突变与克山病心肌损伤发生发展的关系。方法采用临床流行病学方法调查,随机抽取年龄、性别相匹配的慢型和潜在型克山病患者、病区正常组和非病区正常组各30例血样,提取基因组DNA,采用PCR扩增、酶切、电泳等技术比较各组Desmin基因片断酶切位点的变化。结果慢型和潜在型克山病患者与病区正常组未检出Desmin基因exon6的A360P错义突变位点。结论Desmin基因exon6的A360P错义突变可能不是克山病心肌损伤的易感基因突变。     

人类OPRM1-EXON1的克隆与探针的制备

目的　克隆、测序人类 OPRM1- EXON1,并用非同位素 生物素标记法对该基因进行标记、制备探针,用于OPRM1- EXON1的表达及功能研究。方法　通过PCR法扩增目的基因片段,并将其连接到pGEM- T载体上,转入感受态细胞中进行重组并克隆,经酶切和基因测序进行鉴定,用非同位素 生物素标记法进行探针的标记与制备。结果　经过PCR扩增的目的基因片段大小(2.2 kb)与理论上片段大小一致,经过测序证实其序列与 NCBI提供的序列相同,用此片段成功的制备了用于研究阿片受体基因的探针。结论　从基因组中成功克隆了人类 OPRM1- EX ON1,并制备了探针,为深入研究吗啡依赖相关基因及基因表达创造了必要的条件。     

人神经生长因子的基因克隆和序列分析

目的　克隆人神经生长因子基因编码区。方法　由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ,利用PCR法 ,从DNA中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA片段 ;将获得的基因片段插入 pGEM T Easy质粒中 ,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果　经质粒DNA酶切分析及序列测定 ,获得了人神经生长因子DNA片段序列。结论　首次由人白细胞DNA中克隆获得了人神经生长因子基因 ,为神经生长因子的基因治疗提供了前提条件。     

人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

目的　扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因 ,将其克隆到T载体来构建T载体文库。方法　收集乳腺癌患者外周转移淋巴结 30例 ,TRIzol法提取总RNA、纯化mRNA ,行RT PCR扩增 ,制备T载体 ,用于PCR产物的克隆。结果　总RNA纯度高 ,完整性好 ,mRNA获得率为 1%。经RT PCR ,VH、Vλ、Vκ的每一条 5 '端引物均与其相应的 3'端引物成功地扩增出了可变区基因片段 ,轻、重链T载体库分别为 1.7× 10 8和 3.5× 10 8。结论　所采用的引物能够10 0 %扩增目的片段 ,T载体过渡能显著提高克隆效率 ,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。     

人乳头瘤病毒11型E6基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的　为构建人乳头瘤病毒 1 1型 (HPV1 1 )DNA疫苗 ,从尖锐湿疣病变组织中克隆疫苗靶基因E6。方法　利用改良提取染色体外游离DNA的方法制备模板DNA ,采用聚合酶链反应(PCR)技术进行基因克隆。结果　从病变组织中扩增出了全长人乳头瘤病毒 1 1型E6基因完整开放阅读框架 ,并插入中介载体T easy中构建重组质粒 ,转化JM1 0 9扩增后经酶切、PCR及测序分析 ,证实克隆成功。结论　该实验的成功为下一步制备HPV1 1的治疗性疫苗奠定基础。     

用碱性裂解法提取人血凝块中基因组DNA

目的建立一种新的从人血凝块中提取基因组DNA的方法。方法血凝块于室温自然解冻,匀浆,碱消化,酚氯仿抽提,电泳检测。结果用碱性裂解法从人血凝块中成功提取到基因组DNA,提取的DNA质量浓度平均为0.46 g/L,且吸光度比值A260/A280>1.8,选取人Gpx-1基因作PCR获得满意的目的片段。结论用碱性裂解法提取的基因组DNA的总量较高,提取效率高,PCR扩增效果好,可很好的应用于血凝块基因组DNA的提取。     

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。     

人脑源性神经营养因子基因克隆及序列分析

目的　克隆人脑源性神经营养因子 (hBDNF)基因并进行序列分析。方法　提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板 ,应用PCR技术和T 载体克隆法克隆hBDNF基因 ,筛选阳性克隆、酶切鉴定 ,并进行序列测定和分析。结果　DNA序列测定的结果与GenBank提供的已知序列 (M6 1 1 81 )比较 ,所克隆的hBDNF基因从起始密码子ATG到终止密码子TAG全长共744bp ,序列完全相同。结论　自人基因组DNA中克隆hBDNF基因 ,为进一步开展阿尔茨海默病 (AD)的基因治疗积累了资料。     

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。     

STUDY OF ECK GENE EXON-3 FROM HUMAN NORMAL TISSUE AND BREAST CANCER CELL LINE

ECK (epithelialcellkinase) ,alsonamedasEphA 2 ,isoneofthemembersofEphAsubfamilyinEphfamily .ECK protein ,atransmembranety rosinekinase[1] ,canbestructurallydividedintothreedomainsaccordingtotheirpositionsincells.ThreedomainsareexternaldomainwithanN ter minalsignalpeptide ,atransmembranedomainandacytoplasmicdomainwhichincludesacanonicalpro tein tyrosinekinasecatalyticdomain .ECKiswide lyexpressedinavarietyofhumantissues ,abun dantly presentinlung ,skin ,smallintestineandovary .ECKisalsoe…     

CLONING AND SEQUENCING OF MATURED FRAGMENT OF HUMAN NEVER GROWTH FACTOR GENE

Humannervegrowthfactor (hNGF)istheear liestrevealedcellulargrowthregulator.Researchershaveattainedafairlygoodunderstandingofthisnu tritionalfactorthatisessentialtothesurvival,growthanddifferentiationofcentralandperipheralnerves.Theclinicaluseofnerve growthfactor(NGF)hasapotentialtorepairorregrowdamagednerves,topreventandtreatretrogradeneurologicaldiseases,andto promotedifferentiationofneuro blast .Thepreviousstudieshaveshownthatdirectpu rificationofNGFisdifficultandoflessproductionwhilegen…     

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定

目的用含丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的cDNA片段构建酵母双杂交诱饵载体,并进行人胎肝cDNA文库的扩增、纯化和鉴定。方法PCR扩增含HCV core蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。扩增人胎肝cDNA文库并纯化、鉴定。结果获得含HCVcore蛋白的cDNA片段,并成功克隆入pGBKT7中。待转化的人肝cDNA文库滴度在5×108左右,纯化后的质粒DNA质量浓度约1 g/L。用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切显示插入片段大小不一。结论成功构建了核心蛋白的酵母双杂交诱饵载体;扩增、纯化的人胎肝cDNA文库的多样性很好,适合于筛选。为用酵母双杂交技术研究与HCV core蛋白相互作用的蛋白打下坚实基础。     

TSH RECEPTOR GENETIC ALTERATIONS IN THE AUTONOMOUSLYFUNCTIONING THYROID ADENOMAS

Objective To determine the relationship between TSH receptor gene mutations and autonomously functioning thyroid adenomas (AY‘]rAs). Methods The thyroid samples from 14 cases of diagnosed AFTAs were analyzed, with normal thyroid specimens adjacent to the tumors as controls. The 155 base pairs DNA fragments which encompassed the third cytoplasmic loop and the sixth transmembrane segments in the TSH receptor gene exon 10 were amplified by Polymerase chain reaction (PCR) and analyzed by the single-strand conformation polymorphism (SSCP). Direct sequencing of the PCR products was performed with Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit.Results 6 of 14 AFTA specimens displayed abnormal migration in SSCP analysis. In sequence analysis of 3 abnormally migrated samples, one base substitution at nucleotide 1957 (A to C) and two same insertion mutations of one adenosine nucleotide between nucleotide 1972 and 1973 were identified. No mutations were found in controls. Conclusion This study confirmed the presence of TSH receptor gene mutations in AFTAs; both one-point substitution mutation and onebase insertion mutation were found to be responsible for the pathogenesis of AFTAs.     

重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL-12)的构建和真核表达

克隆人 IL - 1 2 ( h IL - 1 2 ) p40和 p35亚单位 c DNA,构建人单链 IL- 1 2 ( rhsc IL- 1 2 )融合基因 ,并在哺乳动物细胞中进行表达。方法　从经 PDBu刺激的 EBV转化的人 B淋巴母细胞株 NC37中提取 m RNA,经 RT- PCR分别获得 h IL- 1 2 p40和 p35亚单位编码序列的 c DNA,运用重组 PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头 ( Gly4 Ser) 3 DNA序列进行体外基因重组 ,构建 rhsc IL- 1 2融合基因 ,将其插入 pc DNA3.1 ( + )真核表达载体 ,经脂质体转染 COS7细胞进行表达 ,Western blot进行分析。结果　所克隆的 h IL- 1 2 p40、p35c DNA序列和构建的 rhsc IL - 1 2融合基因 DNA序列均经测序得以证实 ,融合基因可在 COS7中表达其产物 rhsc IL- 1 2融合蛋白 ,其分子量为 70 KD,可与鼠抗人 IL - 1 2 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论　本研究结果为进一步探讨 rhsc IL- 1 2融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础 ,也为 rhsc IL- 1 2融合基因在原核细胞中的表达提供了可能性     

CLONING AND EXPRESSION OF A GENE MEDIATING γ-RADIATION-INDUCED APOPTOSIS IN HL-60 CELLS

Apoptosis,orprogrammedcelldeath(PCD),isanintricatelyregulatedprocess">.Geneticstud-iesofapoptosisinCaenorhabditiseleganshavei-dentifiedced-3andced-4asproapoptoticgenesandced-9asanantiapoptoticgene"=-Severalmam-malianhomologuesofced-3,ced-4andced-9havebeenidentified.Recentstudiesindicatethatthefundamentalapoptosismachinery,whichconsistsofdistincteffectors,inhibitorsandinitiators,hasbeenconservedthroughoutevolution.Thekeyapoptosiseffectorsinmammalsareafamilyofcys-teine-containing,aspartate-spe…     

人神经营养素-3成熟蛋白基因克隆及序列分析

应用 PCR技术 ,分别以 2个健康成人末梢血白细胞染色体 DNA为模板 ,扩增出人神经营养素 - 3( h NT- 3)成熟蛋白基因 ,并克隆至原核质粒 p UC1 9中进行基因序列测定。将所得序列与 Gen Bank提供的序列 ( M6 1 1 80 )进行对比 ,结果显示一序列与已知序列完全一致 ,另一序列中第 1 41、2 0 4和 2 1 9位碱基发生了改变 ,但改变的碱基不影响其编码的氨基酸。     

丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆和表达丙型肝炎病毒（HCV）1b型地方株DY株ns5a基因。方法运用原核细胞基因工程技术。设计目的基因的特异引物，采用巢式PCR法，从含HCV1bDY株全长eDNA的质粒HCV17中扩增出约480bp的目的片段，将其插入克隆载体pMD18-Tvector中，再亚克隆到原核表达载体pET-28a中；经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株，在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达；采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白的表达水平。结果成功构建了含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体，并得以表达。结论成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因，为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的Ns5A蛋白的性质和生物学活性创造了条件。